Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis
Summary
Descrito é um protocolo para o desenvolvimento de uma população de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) em culturas de grãos pequenos com uso de metilo metanesulfonato (EMS) como um mutagênico. Também é fornecido um protocolo para detecção de mutação usando o ensaio cel-1.
Abstract
O direcionamento de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência em genes alvo. O TILLING é uma ferramenta de genômica funcional altamente valiosa para validação genética, especialmente em pequenos grãos em que abordagens baseadas em transformação possuem sérias limitações. O desenvolvimento de uma população mutagenizada robusta é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência geral da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para encontrar mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população, conduzindo a um insuficiente número de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma população efetiva é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações em um gene de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O ensaio de cel-1 e a aproximação gel-baseada do agarose para a identificação do mutante são convenientes, reprodutíveis, e uma plataforma menos recurso-intensiva. É vantajoso que seja simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional, e é especialmente adequado para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório básico. No presente artigo, descrevem-se os métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR .
Introduction
As mutações pontuais nos genomas podem servir a muitos propósitos úteis para os pesquisadores. Dependendo de sua natureza e localização, essas mutações podem ser usadas para atribuir funções a genes ou até mesmo domínios distintos de proteínas de interesse. Por outro lado, como fonte de nova variação genética, mutações úteis podem ser selecionadas para as características desejadas usando telas de fenotipagem e mais utilizadas na melhora da cultura. O TILLING é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência no gene alvo. Desenvolvido pela primeira vez em Arabidopsis1 e Drosophilia melanogaster2, as populações de lavoura foram desenvolvidas e utilizadas em muitas culturas de grãos pequenos, como o trigo de pão hexapóide (Triticum aestivum)3, cevada (Hordeum vulgare)4, trigo duro tetrapóide (t. usambarense duro)5, trigo diploide (t. monococcum)6 e o progenitor do genoma “D” do trigo Aegilops tauschii7 . Esses recursos têm sido utilizados para validar os papéis dos genes na regulação da tolerância ao estresse abiótico e biótico8, regulando o tempo de floração9e desenvolvendo variedades de culturas nutricionalmente superiores5.
O cultivo, juntamente com o uso de agentes mutagênicos alquilantes, como o metilo metanesulfonato (EMS), azida sódica, N-metil-N-nitrosourea (MNU) e metanesulfonato de metilo (MMS), tem vantagens sobre outras ferramentas de genética reversa por várias razões. Em primeiro lugar, a mutagenese pode ser conduzida em praticamente qualquer espécie ou variedade de plantas10 e é independente do gargalo de transformação, o que é particularmente desafiador no caso de pequenos grãos11. Em segundo lugar, além de gerar mutações Knockout que podem ser obtidas por outras abordagens de validação genética, uma gama de mutações missense e splicing pode ser induzida, o que pode discernir funções de domínios individuais das proteínas de interesse12. Além disso, o TILLING gera uma coleção imortal de mutações em todo o genoma; assim, uma única população pode ser usada para a validação funcional de genes múltiplos. Em contrapartida, outras ferramentas de genética reversa geram recursos específicos apenas para o gene em estudo13. Mutações úteis identificadas através do TILLING podem ser implantadas para fins de reprodução e não estão sujeitas à regulação, diferentemente da edição gênica, cuja classificação não transgênica ainda é incerta em muitos países. Isso se torna especialmente relevante para pequenos grãos que são negociados internacionalmente14.
O TILLING é uma estratégia de validação genética simples e eficiente e requer que populações mutagenizadas sejam desenvolvidas para investigar genes de interesse. O desenvolvimento de uma população mutagenizada efetiva é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência total da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população e a um número insuficiente de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma boa população é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações nos genes de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O sequenciamento do genoma completo e o sequenciamento do exoma têm sido utilizados para caracterizar todas as mutações em populações de lavantes em plantas com pequenos genomas15,16. O sequenciamento de exome de duas populações de TILLING tem sido realizado em pão e trigo duro e está disponível ao público para identificar mutações desejáveis e ordenar linhas mutantes de interesse17. É um grande recurso público em termos de disponibilidade de mutações desejáveis; Entretanto, em estudos da validação do gene, a linha do selvagem-tipo deve possuir o gene do candidato do interesse. Infelizmente, ainda é custo-proibitivo para sequenciar o exoma de toda a população de TILLING para validação reversa baseada em genética de alguns genes candidatos em outro fundo. O sequenciamento de amplicon e os ensaios baseados em cel-1 têm sido usados na detecção de mutações em populações direcionadas em trigo, e os ensaios cel-1 são mais simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional e são especialmente adequados para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório6,18.
No presente artigo, descrevem-se métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR . Este protocolo já foi implementado com sucesso no desenvolvimento e utilização de populações mutagenizadas de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, cevada, Aegilops tauchii7e várias Outros. Incluídos são detalhes explícitos destes métodos, juntamente com dicas úteis que ajudarão os pesquisadores a desenvolver populações de TILLING, usando EMS como um mutagênico em qualquer planta de grãos de pequeno porte de escolha.
Protocol
Representative Results
Discussion
O TILLING é uma ferramenta de genética reversa altamente valiosa para validação de genes, especialmente para pequenos grãos, onde abordagens baseadas em transformação têm gargalos sérios11. Desenvolver uma população mutagenized com uma freqüência elevada da mutação é uma das etapas críticas em conduzir estudos funcionais da genômica. A etapa a mais importante em desenvolver uma população robusta do TILLING é determinar a concentração óptima de EMS. A taxa de sobrevida de 40…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo USDA Instituto Nacional de alimentos e agricultura, Hatch projeto 1016879 e Maryland agricultural Experiment Station via MAES Grant no. 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
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