Här presenterar vi ett ex-vivo blandat enskiktslager kultur system för studier av Human gliom cell (HGC) migration i realtid. Denna modell ger möjlighet att observera interaktioner mellan hgcs och både myelinerade och icke-myeliniserade axoner inom en uppdelade kammare.
Glioblastom är en av de mest aggressiva mänskliga cancerformer på grund av omfattande cellulära heterogenitet och migration egenskaper hGCs. För att bättre förstå molekylära mekanismer bakom gliom cell migration, en förmåga att studera samspelet mellan hgcs och axoner inom tumören mikromiljö är viktigt. För att modellera denna cellulära interaktion, utvecklade vi ett blandat kultur system bestående av hGCs och dorsala root ganglier (DRG) Axon-oligodendrocyte Co-kulturer. DRG kulturer valdes eftersom de kan isoleras effektivt och kan bilda de långa, omfattande prognoser som är idealiska för migration studier av detta slag. Renade råtta oligodendrocyter lades sedan på renade råtta DRG axoner och inducerade till myelinat. Efter att ha bekräftat bildandet av kompakta myelin, var hGCs slutligen till samkulturen och deras interaktioner med DRG axoner och oligodendrocyter övervakades i realtid med hjälp av Time-lapse mikroskopi. Under dessa förhållanden, hgcs bilda tumör-liknande aggregerade strukturer som uttrycker gfap och Ki67, migrera längs både myeliniserade och icke-myeliniserade axonala spår och interagera med dessa axoner genom bildandet av pseudopodia. Vårt ex vivo Co-Culture-system kan användas för att identifiera nya cellulära och molekylära mekanismer för hGC-migration och kan potentiellt användas för in vitro-testning av läkemedels effekt.
Glioblastoma är en av de mest aggressiva och dödliga tumörer i den mänskliga hjärnan. Den nuvarande standarden på vården inkluderar kirurgisk resektion av tumören följt av strålning1 plus samtidig och adjuvant administrering av temozolomid2. Även med denna multi-terapeutiska tillvägagångssätt, tumör upprepning är oundvikligt3. Detta beror delvis på den omfattande flyttande natur tumörceller, som invaderar hjärnparenkymet skapa flera finger-liknande projektioner i hjärnan4 som gör fullständig resektion osannolikt.
Under de senaste åren har det blivit uppenbart att aggressivitet glioblastoma beror delvis på närvaron av en population av cancer stamceller inom tumör massan5,6, som uppvisar hög migrations potential7,8, resistens mot kemoterapi och strålning9,10 och förmågan att bilda sekundära tumörer11. GSCs kan rekapitulera ursprungliga polyklonala tumörer när xenografted till naken möss5.
Trots den rikedom av kunskap om den genetiska bakgrunden av glioblastomas, studier på gliom cell (GC) migration hindras för närvarande av brist på effektiva in vitro-eller in vivo migration modeller. Särskilt, medan gliom cell-axonal interaktioner modulerad av cellulära och miljömässiga faktorer är en kärnkomponent i gliom invasion, till vår kännedom finns det för närvarande inget experimentellt system med förmågan att modellera dessa interaktioner12,13,14. För att åtgärda denna brist utvecklade vi ett ex vivo kultur system av primära hgcs Co-odlade med renade DRG Axon-oligodendrocyter som resulterar i förhöjda uttryck av differentierade tumörmarkörer samt omfattande migration och interaktion av hgcs med myelinerade och icke-myeliniserade fibrer. Denna ex vivo plattform, på grund av dess uppdelade layout, är lämplig för att testa effekterna av nya Therapeutics på hGC migrationsmönster.,
Migrationsstudier för hGCs kan utföras med hjälp av Boyden kammar system eller Scratch analyser. Men medan dessa experiment misslyckas med att ge någon information om samspelet mellan tumörceller med andra omgivande vävnader, kan det nuvarande systemet recapitulate GC interaktioner med myeliniserade och icke-myeliniserade fibrer. Vidare, för att studera tumör bildning och slutpunkts migration, organotypic slice kulturer av gnagare hjärnan eller in vivo implantation av gliom celler i gnagare hjärnan eller flanke…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av interna medel från Institutionen för neurokirurgi, Brown University till N.T.
100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
Biotin | Sigma | B4639 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
D-Glucose | Sigma | G5146 | |
DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
DNase I | Sigma | D7291 | |
Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
EBSS | Sigma | E7510 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
FUDR | Sigma | F0503 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
NAC | Sigma | A8199 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
Ordinary forceps | |||
P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
Papain | Worthington | LS003126 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
Transferrin | Sigma | T2036 | |
Uridine | Sigma | U3003 |