استخدام التصوير المقطعي المحوسب للأشعة السينية الدقيقة مع إعداد حمض فوسفيوالتنغستن لتصور الأنسجة الليفية البشرية
Summary
التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة فعال في الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد من عينات بشرية غير تالفة ولكن له نجاح محدود في مراقبة الأنسجة الرخوة. استخدام عامل تباين حمض فوسفوستجينستيك يمكن حل هذه المشكلة. نفذنا هذا العامل التباين لفحص الأنسجة الليفية الحساسة البشرية (الرباط الاحتفاظ orbicularis).
Abstract
تشريح يدوي والمراقبة النسيجية هي الأساليب الشائعة المستخدمة للتحقيق في الأنسجة البشرية. ومع ذلك، يمكن أن يضر التشريح اليدوي الهياكل الحساسة، في حين أن المعالجة والمراقبة النسيجية توفر معلومات محدودة من خلال التصوير المقطعي. التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة (microCT) هو أداة فعالة للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد دون عينات ضارة. ومع ذلك، فإنه يظهر كفاءة محدودة في التمييز بين أجزاء الأنسجة الرخوة. استخدام عوامل تعزيز التباين، مثل حمض فوسفيوالتنغستن (PTA)، يمكن أن يحل هذه المشكلة عن طريق تحسين تباين الأنسجة الرخوة. قمنا بتنفيذ microCT مع PTA للتحقيق في الرباط الاحتفاظ orbicularis الإنسان (ORL)، وهو هيكل دقيق في منطقة المدار. في هذه الطريقة، يتم إصلاح العينات التي تم حصادها في formalin، المجففة في حلول الإيثانول التسلسلي، وملطخة بمحلول PTA. بعد تلطيخ، يتم إجراء المسح الضوئي microCT، وإعادة الإعمار 3D، والتحليل. الجلد, الأربطة, والعضلات يمكن تصورها بوضوح باستخدام هذه الطريقة. حجم العينة ومدة تلطيخ هي السمات الأساسية للطريقة. وكان سمك العينة المناسب حوالي 5-7 ملم، والتي تباطأت فوقها العملية، وكانت المدة المثلى 5-7 أيام، والتي تحدث تحتها ثقب فارغ في المنطقة الوسطى في بعض الأحيان. للحفاظ على موقع واتجاه القطع الصغيرة أثناء القطع، ينصح الخياطة على نفس المنطقة من كل جزء. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى تحليلات أولية للهيكل التشريحي لتحديد كل قطعة بشكل صحيح. يمكن استخدام Parafilm لمنع التجفيف، ولكن ينبغي توخي الحذر لمنع تشويه العينة. وأظهرت ملاحظتنا متعددة الاتجاهات أن ORL يتكون من شبكة متعددة الطبقات من لوحات مستمرة، بدلا من الألياف مثل الخيط، كما ذكر سابقا. وتشير هذه النتائج إلى أن المسح المجهري مع PTA مفيد لفحص مقصورات محددة داخل الهياكل المعقدة للأنسجة البشرية. قد يكون من المفيد في تحليلات أنسجة السرطان, أنسجة الأعصاب, وأجهزة مختلفة, مثل القلب والكبد.
Introduction
عادة ما يستخدم التشريح اليدوي والمراقبة النسيجية لفحص الأنسجة البشرية، مثل العضلات والأنسجة الضامة. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي التشريح اليدوي بسهولة إلى تلف الهياكل الحساسة، وتوفر المراقبة النسيجية معلومات محدودة حول الأسطح المسطحة المقطعية1و2. لذلك، هناك حاجة إلى أساليب محسنة لفحص الأنسجة بشكل أكثر دقة وكفاءة.
يستخدم التصوير المقطعي المحوسب التقليدي (CT) بشكل عام في الممارسة السريرية، ولكنه يفتقر إلى القدرة على التمييز بين الهياكل الصغيرة2،3. التصوير المقطعي المحوسب (microCT) هو أداة فعالة للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للهياكل الصغيرة من العينات، دون تدميرها. ومع ذلك، microCT لديها تطبيقات محدودة لأنه يمكن تصور الأنسجة الكثيفة فقط بوضوح. لا يمكن استخدامه للتمييز بين الأنسجة الرخوة. للتغلب على هذا القيد، يمكن استخدام عوامل تلطيخ. عوامل تعزيز التباين، مثل حمض فوسفيوالتنغستن (PTA)، وحمض فوسفلوميبديك، واليود لوغول، وتحسين معدل تباين الأنسجة الرخوة أثناء المسحالضوئي 4،5. العديد من الدراسات مقارنة هذه العوامل تشير إلى أن PTA يدل على الأداء الجيد وسهلة للتعامل مع6،7،8.
الأربطة الاحتفاظ orbicularis (ORL) هو بنية حساسة حول المدار، والتي يمكن أن تتلف بسهولة خلال المراقبة التقليدية9. قمنا بفحص واسترداد بنجاح المعلومات 3D على هذا الهيكل باستخدام microCT مع PTA كعامل تباين. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على الدراسات على الأنسجة البشرية الأخرى، مثل القلب والكبد، مع التعديلات المناسبة10،11،12.
Protocol
Representative Results
Discussion
نفذنا microCT مع إعداد PTA في فحص الأنسجة الرخوة البشرية. باختصار، يتم حصاد العينات وثابتة في formalin لبضعة أيام، تليها الجفاف في حلول الإيثانول المسلسل. وضع العينة في حل PTA مباشرة بعد تثبيت formalin يمكن أن يؤدي إلى بعض تكسير الأنسجة بسبب الجفاف السريع. لذلك، هناك حاجة إلى الجفاف التسلسلي قبل تلطيخ PTA….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل هيئة التدريس منحة البحوث من كلية الطب جامعة يونسي (6-2018-0099). ويشكر المؤلفون الأشخاص الذين تبرعوا بسخاء كبير بأجسادهم إلى كلية الطب بجامعة يونسي. ونحن ممتنون لجون هو كيم وجونغ هو بانغ على دعمهما التقني (الموظفون في مركز تعليم التشريح الجراحي في كلية الطب بجامعة يونسي). ونحن ممتنون أيضا لGenoss المحدودة لنظام المسح الضوئي microCT عالية الجودة المستخدمة في هذا البحث.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
