İnsan Fibromusküler Doku Görselleştirmek için Fosfotungstik Asit Hazırlık ile Mikro X-Ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı
Summary
Mikro X-ışını bilgisayarlı tomografi, hasar görmemiş insan örneklerinden üç boyutlu bilgi elde etmede etkilidir ancak yumuşak dokuları gözlemlemede sınırlı başarıya sahiptir. Fosfotungstik asit kontrast madde kullanımı bu sorunu çözebilir. Biz insan hassas fibromusküler dokuları incelemek için bu kontrast ajan uygulanan (orbicularis istinligament).
Abstract
Manuel diseksiyon ve histolojik gözlem insan dokularını araştırmak için kullanılan yaygın yöntemlerdir. Ancak, manuel diseksiyon hassas yapılara zarar verebilir, işleme ve histolojik gözlem kesitsel görüntüleme yoluyla sınırlı bilgi sağlarken. Mikro X-ışını bilgisayarlı tomografi (mikroCT) örneklere zarar vermeden üç boyutlu bilgi elde etmek için etkili bir araçtır. Ancak, yumuşak doku parçaları ayırt sınırlı verimlilik gösterir. Fosfotungstik asit (PTA) gibi kontrast arttırıcı ajanların kullanımı, yumuşak doku kontrastını geliştirerek bu sorunu çözebilir. Yörünge alanında hassas bir yapı olan insan orbicularis istinat ligamentini (ORL) araştırmak için PTA ile mikroCT uyguladık. Bu yöntemde, hasat edilen numuneler formalin olarak sabitlenir, seri etanol çözeltilerinde susuz kalır ve PTA çözeltisi ile boyanmıştır. Boyama sonrası mikroCT taraması, 3Boyutlu rekonstrüksiyon ve analiz yapılır. Cilt, ligamentler ve kaslar bu yöntemle açıkça görselleştirilebilir. Numune boyutu ve boyama süresi yöntemin temel özellikleridir. Uygun numune kalınlığı yaklaşık 5-7 mm idi ve bu işlem yavaşladı ve optimum süre 5-7 gün idi, aşağıda merkezi alanda bir boşluk zaman zaman oluştu. Kesme sırasında küçük parçaların yerini ve yönünü korumak için, her parçanın aynı bölgesinde dikiş önerilir. Ayrıca, her parçanın doğru bir şekilde tanımlanması için anatomik yapının ön analizlerine ihtiyaç vardır. Parafilm kurumasını önlemek için kullanılabilir, ancak numune bozulmasını önlemeye özen verilmelidir. Çok yönlü gözlemimiz, ORL’nin daha önce bildirildiği gibi iplik benzeri lifler yerine sürekli plakalardan oluşan çok katmanlı bir örgüden oluştuğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, PTA ile mikroCT taramasının insan dokusunun karmaşık yapıları içindeki belirli bölmeleri incelemek için yararlı olduğunu göstermektedir. Bu kanser dokularının analizlerinde yararlı olabilir, sinir dokuları, ve çeşitli organlar, kalp ve karaciğer gibi.
Introduction
Manuel diseksiyon ve histolojik gözlem genellikle kaslar ve bağ dokuları gibi insan dokuları incelemek için kullanılır. Ancak, manuel diseksiyon kolayca hassas yapılara zarar verebilir, ve histolojik gözlem düz kesit yüzeyleri hakkında sınırlı bilgi sağlar1,2. Bu nedenle dokuları daha hassas ve verimli bir şekilde incelemek için geliştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.
Konvansiyonel bilgisayarlı tomografi (BT) genellikle klinik uygulamada kullanılır, ancak küçük yapıları ayırt etme yeteneğiyoksundur 2,3. Mikro X-ışını CT (microCT) onları yok etmeden, örneklerden küçük yapıların üç boyutlu (3D) bilgi elde etmek için etkili bir araçtır. Ancak, sadece yoğun dokular açıkça görselleştirilebildiği için microCT sınırlı uygulamalara sahiptir; yumuşak dokuları ayırt etmek için kullanılamaz. Bu sınırlamayı aşmak için boyama maddeleri kullanılabilir. Kontrast arttırıcı ajanlar, fosfotungstik asit gibi (PTA), fosfathomolybdic asit, ve Lugol iyot, tarama sırasında yumuşak doku kontrast oranını artırmak4,5. Bu ajanları karşılaştıran çeşitli çalışmalar PTA iyi performans gösterir ve6,7,8işlemek kolaydır öneririz.
Orbicularis istinat ligament (ORL) yörünge etrafında hassas bir yapıdır, hangi kolayca konvansiyonel gözlem sırasında zarar görebilir9. Kontrast madde olarak PTA ile mikroCT kullanarak bu yapıdaki 3Boyutlu bilgileri inceledik ve başarıyla aldık. Bu yöntem, kalp ve karaciğer gibi diğer insan dokuları üzerinde yapılan çalışmalara uygulanabilir, uygun değişiklikler ile10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan yumuşak dokularının incelenmesinde PTA preparatlı mikroCT uyguladık. Kısaca, numuneler hasat edilir ve birkaç gün formalin sabit, seri etanol çözeltilerinde dehidratasyon takip. Resmiin fiksasyonundan hemen sonra numunenin PTA çözeltisine yerleştirilmesi, hızlı dehidratasyon nedeniyle bazı doku çatlamalarına neden olabilir. Bu nedenle PTA boyamadan önce seri dehidratasyon gereklidir. Daha sonra, örnekler yaklaşık bir hafta boyunca PTA çözeltisi kullanılarak lekelenir. MikroCT taraması, 3D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi’nin araştırma bursu (6-2018-0099) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çok cömertçe Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi’ne vücutlarını bağışladı insanlara teşekkür ederim. Biz Jun Ho Kim ve Jong Ho Bang onların teknik destek için müteşekkiriz (Cerrahi Anatomi Eğitim Merkezi’nde Cerrahi Anatomi Eğitim Merkezi’nde Personel Tıp Fakültesi). Biz de genoss Co, Ltd yüksek kaliteli microCT tarama sistemi bu araştırmada kullanılan için müteşekkiriz.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
