Uso della micrografia computerizzata a raggi X con preparazione dell'acido fosfongstico per visualizzare il tessuto fibromuscolare umano
Summary
La tomografia computerizzata a raggi X microagrafica è efficace nell’ottenere informazioni tridimensionali da campioni umani non danneggiati, ma ha un successo limitato nell’osservazione dei tessuti molli. L’uso di agente di contrasto dell’acido fosfoca e può risolvere questo problema. Abbiamo implementato questo agente di contrasto per esaminare i tessuti fibromuscolari delicati umani (l’orbicularis che mantiene il legamento).
Abstract
La dissezione manuale e l’osservazione istologica sono metodi comuni utilizzati per studiare i tessuti umani. Tuttavia, la dissezione manuale può danneggiare le strutture delicate, mentre l’elaborazione e l’osservazione istologica forniscono informazioni limitate attraverso l’imaging trasversale. La tomografia computerizzata a raggi X micro -x (microCT) è uno strumento efficace per ottenere informazioni tridimensionali senza danneggiare i campioni. Tuttavia, mostra una limitata efficienza nella differenziazione delle parti dei tessuti molli. L’uso di agenti che migliorano il contrasto, come l’acido fosfotungtico (PTA), può risolvere questo problema migliorando il contrasto dei tessuti molli. Abbiamo implementato microCT con PTA per studiare il legamento di mantenimento dell’orbicularis umano (ORL), che è una struttura delicata nell’area dell’orbita. In questo metodo, i campioni raccolti sono fissati in formalina, disidratati in soluzioni di etanolo seriale e macchiati con una soluzione PTA. Dopo la colorazione, vengono eseguite la scansione microCT, la ricostruzione 3D e l’analisi. La pelle, i legamenti e i muscoli possono essere visualizzati chiaramente con questo metodo. Le dimensioni del campione e la durata della colorazione sono caratteristiche essenziali del metodo. Lo spessore del provino adatto era di circa 5-7 mm, al di sopra dei quali il processo è stato rallentato, e la durata ottimale era di 5-7 giorni, al di sotto del quale occasionalmente si è verificato un buco vuoto nella zona centrale. Per mantenere la posizione e la direzione dei piccoli pezzi durante il taglio, si consiglia di cucire sulla stessa regione di ogni parte. Inoltre, sono necessarie analisi preliminari della struttura anatomica per identificare correttamente ogni pezzo. Parafilm può essere utilizzato per prevenire l’essiccazione, ma occorre prestare attenzione per evitare la distorsione del campione. La nostra osservazione multidirezionale ha mostrato che l’ORL è composto da una rete multistrato di piastre continue, piuttosto che fibre simili a fili, come riportato in precedenza. Questi risultati suggeriscono che la scansione microCT con PTA è utile per esaminare compartimenti specifici all’interno di strutture complesse del tessuto umano. Può essere utile nelle analisi dei tessuti tumorali, tessuti nervosi, e vari organi, come il cuore e il fegato.
Introduction
La dissezione manuale e l’osservazione istologica sono tipicamente utilizzate per esaminare i tessuti umani, come i muscoli e i tessuti connettivi. Tuttavia, la dissezione manuale può facilmente danneggiare strutture delicate e l’osservazione istologica fornisce informazioni limitate sulle superfici trasversali piatte1,2. Pertanto, sono necessari metodi migliorati per esaminare i tessuti in modo più preciso ed efficiente.
La tomografia computerizzata convenzionale (TC) è generalmente utilizzata nella pratica clinica, ma manca della capacità di distinguere piccole strutture2,3. Micro X-ray CT (microCT) è uno strumento efficace per ottenere informazioni tridimensionali (3D) di piccole strutture da campioni, senza distruggerli. Tuttavia, la microCC ha applicazioni limitate perché solo i tessuti densi possono essere visualizzati chiaramente; non può essere utilizzato per differenziare i tessuti molli. Per superare questa limitazione, è possibile utilizzare gli agenti di colorazione. Agenti che migliorano il contrasto, come l’acido fosfotungstico (PTA), l’acido fosfolitillimpico e lo iodio di Lugol, migliorano il tasso di contrasto dei tessuti molli durante la scansione4,5. Diversi studi che confrontano questi agenti suggeriscono che PTA dimostra buone prestazioni ed è facile da gestire6,7,8.
Il legamento di mantenimento orbicularis (ORL) è una struttura delicata intorno all’orbita, che può essere facilmente danneggiata durante l’osservazione convenzionale9. Abbiamo esaminato e recuperato con successo informazioni 3D su questa struttura utilizzando microCT con PTA come agente di contrasto. Questo metodo può essere applicato a studi su altri tessuti umani, come il cuore e il fegato, con modifiche appropriate10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo implementato microCT con preparazione PTA nell’esame dei tessuti molli umani. In breve, i campioni vengono raccolti e fissati in formalina per alcuni giorni, seguiti dalla disidratazione nelle soluzioni di etanolo seriale. L’inserimento del campione nella soluzione PTA direttamente dopo la fissazione della formalina può provocare alcune crepe dei tessuti a causa della rapida disidratazione. Pertanto, la disidratazione seriale è necessaria prima della colorazione PTA. Successivamente, gli esempi vengono macchiat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una borsa di ricerca facoltà di Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Gli autori ringraziano le persone che hanno generosamente donato i loro corpi allo Yonsei University College of Medicine. Siamo grati a Jun Ho Kim e Jong Ho Bang per il loro supporto tecnico (membri del personale del Centro di educazione all’anatomia chirurgica presso lo Yonsei University College of Medicine). Siamo anche grati a Geoss Co., Ltd. per il sistema di scansione microCT di alta qualità utilizzato in questa ricerca.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
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