Dit protocol beschrijft de oprichting van een tumor-lager muismodel om te controleren van de progressie van de tumor en angiogenese in real-time door dubbele bioluminescentie beeldvorming.
Angiogenese, als een cruciale proces van tumorprogressie, is uitgegroeid tot een onderzoek hotspot en doelwit van anti-tumor therapie. Er is echter geen betrouwbaar model voor het traceren van tumorprogressie en angiogenese tegelijkertijd op een visuele en gevoelige manier. Bioluminescentie Imaging toont zijn unieke superioriteit in levende beeldvorming vanwege de voordelen van hoge gevoeligheid, sterke specificiteit en nauwkeurige meting. Gepresenteerd hier is een protocol om een tumor-dragende muismodel te vestigen door het injecteren van een renilla plaats-gelabelde Murine borstkanker cellijn 4t1 in de transgene muis met angiogenese-geïnduceerde Firefly plaats expressie. Dit muismodel biedt een waardevol hulpmiddel om gelijktijdig tumorprogressie en angiogenese in real-time te monitoren door dubbele bioluminescentie beeldvorming in één muis. Dit model kan op grote schaal worden toegepast in anti-tumor drug screening en oncologie onderzoek.
Angiogenese is een essentieel proces in de progressie van kanker van kleine, gelokaliseerde Neoplasmata tot grotere, mogelijk gemetastaseerde tumoren1,2. De correlatie tussen tumorgroei en angiogenese wordt een van de punten van de nadruk op het gebied van oncologie onderzoek. Traditionele methoden voor het meten van morfologische veranderingen zijn echter niet in staat om de tumorprogressie en angiogenese gelijktijdig in levende dieren te monitoren met behulp van een gevisualiseerde benadering.
Bioluminescentie Imaging (bli) van tumorcellen is een bijzonder geschikte experimentele methode om de tumorgroei te monitoren vanwege de niet-invasiviteit, gevoeligheid en specificiteit3,4,5,6 . Bli-technologie is gebaseerd op het principe dat de plaats oxidatie van een specifiek substraat kan katalyseren tijdens het uitzenden van bioluminescentie. De plaats uitgedrukt in geïmplanteerde tumorcellen reageert met het geïnjecteerde substraat, dat kan worden gedetecteerd door een levend beeld systeem, en signalen weerspiegelen indirect de veranderingen in het celnummer of cellokalisatie in vivo6,7.
Met uitzondering van tumorgroei, kan tumor angiogenese (de kritieke stap in de progressie van kanker) ook worden gevisualiseerd via bli-technologie met behulp van Vegfr2-Fluc-Ki transgene muizen8,9,10. De vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), één type VEGF-receptor, wordt meestal uitgedrukt in de vasculaire endotheliale cellen van volwassen muizen11. In Vegfr2-Fluc-Ki transgene muizen wordt de DNA-sequentie van Firefly plaats (Fluc) in de eerste Exon van de endogene Vegfr2 sequentie geslagen. Als gevolg hiervan wordt de Fluc uitgedrukt (die verschijnt als BLI-signalen) op een manier die identiek is aan het niveau van angiogenese bij muizen. Om te groeien dan een paar millimeter in grootte, de tumor rekruten nieuwe vasculaturen van bestaande bloedvaten, die sterk uitdrukken de Vegfr2 veroorzaakt door groeifactoren uit tumorcellen1. Dit opent de mogelijkheid van het gebruik van Vegfr2-Fluc-KI transgene muizen tot niet-invasief monitoren van tumor angiogenese door BLI.
In dit protocol, een tumor-dragende muismodel is opgericht om te controleren van de tumorprogressie en angiogenese in een enkele muis door middel van Firefly plaats (Fluc) en renilla plaats (rluc) Imaging, respectievelijk (Figuur 1). Er wordt een 4T1-cellijn (4T1-RR) gemaakt dat Rluc en Red fluorescent proteïne (RFP) stabiel uitdrukt om celgroei te traceren door Rluc Imaging. Om verder onderzoek te doen naar de dynamische veranderingen van angiogenese in de progressie en regressie van de tumor, wordt een andere 4T1 cellijn (4T1-RRT) gemaakt die het zelfmoord genherpes simplexvirus (afgekort thymidine kinase, HSV-ttk), Rluc en RFP uitdrukt. Door toediening van ganciclovir (GCV), wordt de HSV-ttk die cellen uitdrukt, selectief geablleerd. Op basis van deze cellijnen is een tumor lager model in Vegfr2-Fluc-KI muizen gebouwd dat dient als een experimenteel model dat de tumorprogressie en tumor angiogenese in vivo overbrugt.
In dit protocol wordt een niet-invasieve dubbele BLI-benadering beschreven voor het monitoren van tumor ontwikkeling en angiogenese. Het BLI reporter systeem wordt voor het eerst ontwikkeld, met het HSV-ttk/GCV Suicide gen voor het volgen van tumorprogressie en regressie in vivo door Rluc Imaging. Ondertussen wordt tumor angiogenese beoordeeld met behulp van Vegfr2-Fluc-KI muizen via Fluc Imaging. Dit tumor-lager muismodel is in staat om een praktisch platform te bieden voor continue en niet-invasieve tracking tumor ontw…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door National key R & D-programma van China (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation of China (81671734), en belangrijke projecten van het Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten (63191155). We erkennen de herzieningen van Gloria Nance, die waardevol waren om de kwaliteit van ons manuscript te verbeteren.
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
293T | ATCC | CRL-3216 | |
4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
Isoflurane | Baxter | 691477H | |
Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |