Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen
Summary
Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.
Abstract
Die Genombearbeitung mit dem CRISPR-Cas-System hat die Fähigkeit, die Genome verschiedener Organismen präzise zu bearbeiten, erheblich erweitert. Im Kontext von Säugetierzellen stellt diese Technologie ein neuartiges Mittel dar, um genomweite genetische Screens für funktionelle Genomstudien durchzuführen. Bibliotheken von Guide RNAs (sgRNA), die auf alle offenen Leserahmen abzielen, ermöglichen die einfache Generierung von Tausenden von genetischen Störungen in einem einzigen Pool von Zellen, die auf bestimmte Phänotypen untersucht werden können, um Genfunktion und zelluläre Prozesse in einem unvoreingenommenund systematisch. CRISPR-Cas-Bildschirme bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die genetischen Blaupausen für zelluläre Phänotypen aufzudecken. Darüber hinaus kann die Differentialanalyse von Bildschirmen, die in verschiedenen Zelllinien und aus verschiedenen Krebsarten durchgeführt werden, Gene identifizieren, die kontextuell in Tumorzellen wichtig sind, und potenzielle Ziele für spezifische Krebstherapien aufzeigen. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann entmutigend sein, da dies den Umgang mit zig Millionen Zellen beinhaltet und eine Analyse großer Datenmengen erfordert. Die Details dieser Bildschirme, wie z. B. die Charakterisierung von Zellenlinien, Überlegungen zur CRISPR-Bibliothek und das Verständnis der Einschränkungen und Fähigkeiten der CRISPR-Technologie während der Analyse, werden häufig übersehen. Hier ist ein detailliertes Protokoll für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-basierten Bildschirmen vorgesehen.
Introduction
CRISPR-Cas, kurz für gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurze palindromische Wiederholungen und CRISPR-assoziierte Nuklease, besteht aus einem einzigen Nukleaseprotein (z.B. Cas9) in Komplex mit einer synthetischen Guide RNA (sgRNA). Dieser Ribonukleoprotein-Komplex zielt auf das Cas9-Enzym ab, um doppelsträngige DNA-Brüche an einem bestimmten genomischen Ort1zu induzieren. Doppelsträngige Brüche können durch homology directed repair (HDR) oder, häufiger, durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert werden, ein fehleranfälliger Reparaturmechanismus, der zum Einfügen und/oder Löschen (INDELS) führt, das häufig die Genfunktion stört. 1. Die Effizienz und Einfachheit von CRISPR ermöglicht ein bisher unerreichbares Niveau der genomischen Ausrichtung, das die bisherigen Genom-Editing-Technologien [d.h. Zinkfingernukleasen (ZNF) oder Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen ( weit übertrifft ( TALENS), die beide unter erhöhter Designkomplexität, geringerer Transfektionseffizienz und Einschränkungen bei der Multiplex-Genbearbeitung2] leiden.
Die Grundlagenforschung der CRISPR-Single-Guide-RNA-basierten Genombearbeitung hat es Wissenschaftlern ermöglicht, die Funktionen einzelner Gene und die Topologie genetischer Interaktionsnetzwerke effizient und kostengünstig zu hinterfragt. Die Fähigkeit, funktionelle genomweite Bildschirme durchzuführen, wurde durch den Einsatz des CRISPR-Cas-Systems erheblich verbessert, insbesondere im Vergleich zu früheren genetischen Störtechnologien wie RNA-Interferenz (RNAi) und Gentrap-Mutagenese. Insbesondere leidet RNAi unter hohen Off-Target-Effekten und unvollständigem Knockdown, was zu einer geringeren Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu CRISPR3,4,5führt, während Gentrap-Methoden nur bei haploiden Zellen für Funktionsverlustbildschirme, die den Umfang von Zellmodellen einschränken, die abgefragt werden können6. Die Fähigkeit von CRISPR, einen vollständigen Gen-Knock-out zu erzeugen, bietet ein biologisch robusteres System zur Abhörung mutierter Phänotypen mit geringem Rauschen, minimalen Off-Target-Effekten und konsistenter Aktivität über Reagenzien5. CRISPR-Cas9 sgRNA-Bibliotheken, die auf das gesamte menschliche Genom abzielen, sind jetzt weit verbreitet und ermöglichen die gleichzeitige Generierung von Tausenden von Gen-Knock-outs in einem einzigen Experiment3,7,8,9 .
Wir haben einzigartige CRISPR-Cas9 genomweite sgRNA lentivirale Bibliotheken entwickelt, die Toronto Knock-out (TKO) Bibliotheken (verfügbar über Addgene) genannt werden, die kompakt und sequenzoptimiert sind, um hochauflösende funktionelle Genomik-Bildschirme zu ermöglichen. Die neueste Bibliothek, TKOv3, zielt auf 18.000 menschliche Protein-kodierende Gene mit 71.090 Leitfäden, die für die Bearbeitungseffizienz mit empirischen Daten optimiert sind10. Darüber hinaus ist TKOv3 als Einkomponenten-Bibliothek (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) verfügbar, die Cas9 und sgRNAs auf einem einzigen Vektor ausdrückt, wodurch die Notwendigkeit entsprochen wird, stabile Cas9-expressions-Zellen zu generieren, was genomweite Knock-out in einer breiten Palette von Säugetierzelltypen. TKOv3 ist auch in einem Vektor ohne Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID-Nr. 125517) erhältlich und kann in Zellen verwendet werden, die Cas911ausdrücken.
Eine genomweite CRISPR-Cas9-bearbeitete Zellpopulation kann unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt werden, wobei die Fülle von sgRNAs im Laufe der Zeit durch Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert wird, was eine Auslesung zur Beurteilung von Aussteigern oder Anreicherung von Zellen mit rückverfolgbaren genetischen Störungen. CRISPR-Knock-out-Bibliotheken können genutzt werden, um Gene zu identifizieren, die bei Störungen zelluläre Fitnessdefekte, eine moderate Arzneimittelempfindlichkeit (z. B. empfindliche oder resistente Gene) verursachen, die Proteinexpression regulieren (z. B. Reporter) oder für eine bestimmte Signalwegfunktion und Zellzustand12,13,14. Zum Beispiel können Differential-Fitness-Bildschirme in einer Krebszelllinie sowohl Erschöpfung oder Reduktion von Onkogenen und Anreicherung oder eine Zunahme der Tumorsuppressoren Gene3,14,15identifizieren. In ähnlicher Weise kann die Verwendung von Zwischendosen von therapeutischen Medikamenten sowohl Arzneimittelresistenz als auch Sensibilisierungsgene16,17zeigen.
Hier ist ein detailliertes Screening-Protokoll für das genom-skala CRISPR-Cas9 Verlust-von-Funktions-Screening mit den Toronto Knock-out Bibliotheken (TKOv1 oder v3) in Säugetierzellen von der Bibliotheksgenerierung, Screening-Performance bis zur Datenanalyse. Obwohl dieses Protokoll für das Screening mit den Toronto Knock-out-Bibliotheken optimiert wurde, kann es angewendet werden und auf alle gepoolten CRISPR sgRNA-Bibliotheken skalierbar werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund seiner Einfachheit und hohen Geschmeidigkeit wurde die CRISPR-Technologie weithin als Werkzeug der Wahl für die präzise Genombearbeitung angenommen. Das gepoolte CRISPR-Screening bietet eine Methode, um Tausende von genetischen Störungen in einem einzigen Experiment zu hinterfragt. In gepoolten Bildschirmen dienen sgRNA-Bibliotheken als molekulare Barcodes, da jede Sequenz einzigartig ist und dem Zielgen zugeordnet ist. Durch die Isolierung der genomischen DNA aus der Zellpopulation können Gene, die den Phä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Genome Canada, dem Ontario Research Fund und den Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802) unterstützt.
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
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