मैमलियन सेल में पूल्ड CRISPR-आधारित जेनेटिक स्क्रीन
Summary
CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी ठीक किसी भी सेल प्रकार में स्तनधारी जीनोम को संपादित करने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है और जीनोम व्यापक आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक उपन्यास का मतलब है का प्रतिनिधित्व करता है। एक विस्तृत प्रोटोकॉल जमा जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 स्क्रीन के सफल प्रदर्शन के लिए आवश्यक कदम पर चर्चा यहाँ प्रदान की गई है.
Abstract
CRISPR-Cas प्रणाली का उपयोग जीनोम संपादन काफी ठीक विभिन्न जीवों के जीनोम को संपादित करने की क्षमता उन्नत है. स्तनधारी कोशिकाओं के संदर्भ में, यह तकनीक कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के लिए जीनोम-वाइड आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए एक उपन्यास का अर्थ है। गाइड RNAs के पुस्तकालयों (sgRNA) सभी खुले पढ़ने फ्रेम को लक्षित कोशिकाओं है कि विशिष्ट phenotypes के लिए जांच की जा सकती है की एक पूल में आनुवंशिक क्षोभ के हजारों की सुगम पीढ़ी की अनुमति जीन समारोह और सेलुलर प्रक्रियाओं को फंसाने के लिए एक निष्पक्ष और व्यवस्थित तरीका। CRISPR-Cas स्क्रीन सेलुलर phenotypes के लिए आनुवंशिक ब्लूप्रिंट को उजागर करने के लिए एक सरल, कुशल, और सस्ती विधि के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करते हैं. इसके अलावा, विभिन्न सेल लाइनों में और विभिन्न कैंसर प्रकार से प्रदर्शन स्क्रीन के अंतर विश्लेषण जीन है कि ट्यूमर कोशिकाओं में प्रासंगिक आवश्यक हैं की पहचान कर सकते हैं, विशिष्ट कैंसर विरोधी उपचार के लिए संभावित लक्ष्य ों खुलासा. मानव कोशिकाओं में जीनोम चौड़ा स्क्रीन प्रदर्शन कठिन हो सकता है, क्योंकि यह कोशिकाओं के लाखों लोगों की हैंडलिंग शामिल है और डेटा के बड़े सेट के विश्लेषण की आवश्यकता है. इन स्क्रीन ्स्ड ऑफ सेल लाइन विशेषता, CRISPR लाइब्रेरी विचार, और विश्लेषण के दौरान CRISPR तकनीक की सीमाओं और क्षमताओं को समझने, अक्सर अनदेखी कर रहे हैं। यहाँ प्रदान की जमा जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 आधारित स्क्रीन के सफल प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है.
Introduction
CRISPR-Cas, संकुल के लिए कम नियमित रूप से अंतराल कम palindromic दोहराता है और CRISPR संबद्ध nuclease, एक सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA) के साथ जटिल में एक एकल न्यूक्लीज प्रोटीन (उदाहरण के लिए, Cas9) के होते हैं. इस राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन जटिल एक विशिष्ट जीनोमिक टिड्डी1पर डबल-स्लेड डीएनए ब्रेक को प्रेरित करने के लिए Cas9 एंजाइम को लक्षित करता है। डबल-स्ट्रेंड ब्रेक को होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से मरम्मत किया जा सकता है या, अधिक सामान्यतः, गैर-समजात अंत में शामिल होने के माध्यम से (NHEJ), एक त्रुटि प्रवण मरम्मत तंत्र जिसके परिणामस्वरूप प्रविष्टि और/या विलोपन (INDELS) होता है जो अक्सर जीन फ़ंक्शन को बाधित करता है 1. CRISPR की दक्षता और सादगी जीनोमिक लक्ष्यीकरण के पहले अप्राप्य स्तर को सक्षम बनाती है जो पिछले जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों को पार कर जाती है , जस्ता उंगली न्यूक्लेस (जेडएनएफ) या ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर जैसे प्रभावक न्यूक्लेस ( TALENS), जिनमें से दोनों बढ़ डिजाइन जटिलता से पीड़ित हैं, कम transfection दक्षता, और मल्टीप्लेक्स जीन संपादन2में सीमाओं .
CRISPR एकल गाइड आरएनए आधारित जीनोम संपादन के बुनियादी अनुसंधान आवेदन वैज्ञानिकों कुशलतापूर्वक और सस्ते में व्यक्तिगत जीन और आनुवंशिक बातचीत नेटवर्क के टोपोलॉजी के कार्यों से पूछताछ करने की अनुमति दी है. कार्यात्मक जीनोम चौड़ा स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता बहुत CRISPR-कैस प्रणाली के उपयोग से बढ़ाया गया है, खासकर जब आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) और जीन जाल mutagenesis के रूप में पहले आनुवंशिक क्षोभ प्रौद्योगिकियों की तुलना में. विशेष रूप से, RNAi उच्च बंद लक्ष्य प्रभाव और अधूरा दस्तक से ग्रस्त है, कम संवेदनशीलता और CRISPR3,4,5की तुलना में विशिष्टता में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि जीन जाल तरीकों अगुणित में ही संभव हैं हानि के समारोह स्क्रीन के लिए कोशिकाओं, सेल मॉडल है कि6पूछताछ की जा सकती है के दायरे को सीमित. CRISPR की क्षमता को पूरा जीन नॉक-आउट उत्पन्न करने के लिए एक और अधिक जैविक रूप से मजबूत प्रणाली उत्परिवर्ती phenotypes पूछताछ करने के लिए प्रदान करता है, कम शोर के साथ, कम से कम बंद लक्ष्य प्रभाव और अभिकर्मकों भर में लगातार गतिविधि5. CRISPR-Cas9 sgRNA पुस्तकालयों कि पूरे मानव जीनोम लक्ष्य अब व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, एक ही प्रयोग में जीन नॉक आउट के हजारों की एक साथ पीढ़ी की अनुमति3,7,8,9 .
हम अद्वितीय CRISPR-Cas9 जीनोम चौड़ा sgRNA lentiviral पुस्तकालयों टोरंटो नॉक आउट (TKO) पुस्तकालयों (Addgene के माध्यम से उपलब्ध) कहा जाता है कि कॉम्पैक्ट और अनुक्रम उच्च संकल्प कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीन की सुविधा के लिए अनुकूलित कर रहे हैं विकसित किया है। नवीनतम पुस्तकालय, TKOv3, लक्ष्य $ 18,000 मानव प्रोटीन-कोडिंग जीन के साथ 71,090 गाइड अनुभवजन्य डेटा10का उपयोग कर दक्षता संपादन के लिए अनुकूलित. इसके अतिरिक्त, TKOv3 एक एक घटक पुस्तकालय के रूप में उपलब्ध है (LCV2::TKOv3, Addgene आईडी #90294) एक एकल वेक्टर पर Cas9 और sgRNAs व्यक्त, स्थिर Cas9-expressing कोशिकाओं उत्पन्न करने की आवश्यकता को समाप्त करने, जीनोम-वाइड नॉक-आउट को सक्षम करने की एक विस्तृत श्रृंखला में स्तनधारी कोशिका प्रकार. TKOv3 Cas9 के बिना एक वेक्टर में भी उपलब्ध है (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID] 125517) और Cas911व्यक्त करने वाले कक्षों में उपयोग किया जा सकता है।
एक जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 संपादित सेल आबादी विभिन्न विकास की स्थिति को उजागर किया जा सकता है, अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा निर्धारित समय के साथ sgRNAs की बहुतायत के साथ, ड्रॉप-आउट या ट्रेस करने योग्य आनुवंशिक के साथ कोशिकाओं के संवर्धन का आकलन करने के लिए एक readout प्रदान क्षोभ. CRISPR नॉक-आउट पुस्तकालयों जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि, क्षोभ पर, सेलुलर फिटनेस दोष के कारण, मध्यम दवा संवेदनशीलता (उदाहरण के लिए, संवेदनशील या प्रतिरोधी जीन), प्रोटीन अभिव्यक्ति को विनियमित (उदाहरण के लिए, रिपोर्टर), या एक निश्चित के लिए आवश्यक हैं पथफल और कोशिकीय अवस्था12,13,14. उदाहरण के लिए , कैंसर कोशिका रेखा में अंतर फिटनेस स्क्रीन दोनों कमी या oncogenes और संवर्धन की कमी या ट्यूमर suppressors जीन3,14,15की वृद्धि की पहचान कर सकते हैं . इसी प्रकार चिकित्सीय औषधों की मध्यवर्ती खुराकों का उपयोग करने से औषध प्रतिरोध तथा सुग्राहीकरणजीनोंदोनों को पता चल सकता है.
यहाँ प्रदान की जीनोम पैमाने CRISPR-Cas9 हानि के लिए एक विस्तृत स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल है टोरंटो नॉक-आउट पुस्तकालयों का उपयोग कर समारोह स्क्रीनिंग (TKOv1 या v3) पुस्तकालय पीढ़ी से स्तनधारी कोशिकाओं में, स्क्रीनिंग प्रदर्शन डेटा विश्लेषण करने के लिए. हालांकि इस प्रोटोकॉल टोरंटो नॉक आउट पुस्तकालयों का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है, यह लागू किया जा सकता है और सभी CRISPR sgRNA जमा पुस्तकालयों के लिए स्केलेबल बन जाते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
उपयोग और उच्च लचीलाता की अपनी सादगी के कारण, CRISPR प्रौद्योगिकी व्यापक रूप से सटीक जीनोम संपादन के लिए पसंद के उपकरण के रूप में अपनाया गया है. पूल्ड CRISPR स्क्रीनिंग एक ही प्रयोग में आनुवंशिक क्षोभ के हजारों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम जीनोम कनाडा, ओंटारियो अनुसंधान कोष, और स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों (MOP-142375, PJT-148802) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
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