Характеризуй связанных с болезнями мутантов семейки RAF Kinases с помощью набора практических и осуществимых методов
Summary
В этой статье мы представили набор практических и осуществимых методов для характеристики связанных с болезнями мутантов семейных киназ RAF, которые включают в себя анализ in vitro киназы, анализ совместной активации RAF и дополнительный анализ сплит-люциферазы.
Abstract
Быстро ускоренная фиброзаркома (RAF) семейные киназы играют центральную роль в клеточной биологии и их дисфункция приводит к раку и нарушениям развития. Характеристика связанных с болезнями мутантов RAF поможет нам выбрать соответствующие терапевтические стратегии для лечения этих заболеваний. Недавние исследования показали, что семейные киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность, которая жестко регулируется димеризацией. Здесь мы построили набор практических и осуществимых методов для определения каталитической и аллостерической деятельности и относительной сродства/стабильности киназов семейства RAF и их мутантов. Во-первых, мы внесли изменения в классический анализ in vitro kinase, снизив концентрацию моющего средства в буферах, используя нежную процедуру быстрой стирки и используя фьюжн-передатчик (GST) для предотвращения разъединения RAF димеров во время Очистки. Это позволяет адекватно измерять каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF. Во-вторых, мы разработали новый RAF совместной активации анализ для оценки аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF с помощью N-терминала усеченных белков RAF, устраняя требование активного Раса в текущих протоколах и тем самым достигая более высокого Чувствительность. Наконец, мы создали уникальный дополнительный анализ разделенной люциферазы для количественного измерения относительной сродства/стабильности различных мутантов RAF, которая является более надежной и чувствительной по сравнению с традиционным анализом совместного иммунопреципиции. Таким образом, эти методы имеют следующие преимущества: (1) удобный для пользователя; (2) в состоянии эффективно осуществлять без современного оборудования; (3) рентабельно; (4) очень чувствительны и воспроизводимы.
Introduction
Семейные киназы RAF являются ключевым компонентом каскада сигнализации RAS/RAF/MEK/ERK, которые передают сигнал от РАН для активации митоген-активированного протеина киназы (MEK)1,2,3,4. Это семейство киназ играет решающую роль в росте клеток, выживании и дифференциации, и их изменения вызывают многие заболевания, в частности, рак5,6,7,8. В последнее время геномные секвенирования выявили много связанных с болезнью мутантов RAF, которые обладают различными свойствами в передаче сигнала RAS/RAF/MEK/ERK каскад9,10,11. Тщательная характеристика мутантов RAF поможет нам понять молекулярные механизмы того, как мутанты RAF изменяют сигнальный выход каскада RAS/RAF/MEK/ERK, в конечном итоге выбирая подходящие подходы для лечения различных мутантов, управляемых RAF.
Семьи киназы RAF включают в себя три члена, CRAF, BRAF, и ARAF, которые имеют аналогичные молекулярные структуры, но различные способности, чтобы активировать вниз по течению сигнализации1,2,3,4. Среди этих паралогов, BRAF имеет самую высокую активность в силу своей составно фосфорилированной NtA (N–тerminal cidic) мотив12,13 ,14, в то время как ARAF имеет самый низкий деятельность, вытекающая из его неканонического мотива APE15. Это может объяснить различные частоты мутаций паралогов RAF при заболеваниях: BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. Кроме того, в рамках одного и того же паралога RAF мутации на разных участках могут вызывать сигнализацию вниз по течению в различных манерах, что добавляет еще один уровень сложности к регулированию семейных киназ RAF. Недавние исследования показали, что все киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность13,14,16,17,18. В соответствии с действующими мутантами RAF включить вниз по течению сигнализацию непосредственно фосфорилирование МЭК, в то время как киназы мертвых мутантов RAF могут трансактивировать свои аналоги дикого типа через боковую-стороннюю димеризацию и активировать MEK-ERK сигнализации16 ,19,20. Димер сродство / стабильность является ключевым параметром, который не только определяет аллостерную активность киназы мертвых мутантов RAF, но и влияет на каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF15,21, 22. Киназа-мертвые мутанты RAF с высоким dimer сродством/стабильностью могут transactivate endogenous wild-type RAFs сразу15, пока те с промежуточными dimer сродством/стабильностью требует координации активного Ras или повышенный уровень молекул RAF дикого типа для функции13,15,20,21,23. Аналогичным образом, в совокупности активных raf мутантов фосфорилат MEK в димер-зависимым образом, и те, с низким димер омрачитель близость / стабильность теряют свою каталитическую активность в пробирке на иммунопрециптом, что перерывы слабых RAF dimers15, 21,22. Димер сродство / стабильность также определяет чувствительность raf мутантов к их ингибиторы, и положительно коррелирует с сопротивлением ингибиторов RAF24. Поэтому, чтобы охарактеризовать связанные с болезнями мутанты RAF, необходимо измерить их каталитическую и аллостерную деятельность, а также димерную сродство/стабильность.
В последние годы наша лаборатория и другие разработали различные методы для характеристики семейства киназов RAF и их мутантов. Согласно нашему опыту лаборатории и другим, мы считаем, что следующие три анализа имеют преимущества в определении связанных с болезнью мутантов RAF: (1) анализ in vitro киназы, который может быть проведен с легкостью для обнаружения каталитическая активность составно активные мутанты RAF15; (2) RAF совместноактивации ассс, который является надежным и удобным методом для измерения аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF13,15,21,22,23, 25; (3) бесплатный анализ разделенной люциферазы, который имеет гораздо более высокую чувствительность в измерении относительной сродства димера/стабильности мутантов RAF в отличие от традиционного совместного иммунопреципции, и способен осуществлять без передового оборудования в в отличие от количественных аналитических методов, таких как SPR (Surface Plasmon Resonance) анализ15,22. Сочетая эти три анализа, мы можем легко понять, как связанные с болезнью RAF мутант изменяет вниз по течению сигнализации и тем самым использовать соответствующую терапевтическую стратегию для лечения болезни, вызванной этой мутации RAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представили три метода для характеристики связанных с болезнями мутантов RAF, которые включают в пробирке киназы анализ, RAF совместной активации анализа, и бесплатный анализ раскола luciferase. Так как киназы RAF имеют как каталитическую активность, так и аллостерическую актив…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить волосатые клетки лейкемии стипендий для поддержки Yuan Jimin. Эта работа была поддержана Азиатского фонда онкологических исследований (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Мост Финансирование премии (Дюк-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF преодоление гранта (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF пилотный грант (NCCRF-YR2017-PG- Исследовательский грант (AM/TP011/2018).
Materials
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
References
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
- Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 “kinase”. FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
- Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
- Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
- Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
- McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
- Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
- Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
- Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
- Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
- Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
- Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
- Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
- Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
- Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
- Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
- Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
- Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
- Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
- Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
- Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
- Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
- Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
- Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
- Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. 암 연구학. 61 (9), 3595-3598 (2001).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
- Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).
- Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. “RAF” neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
- García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
- Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
- Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
- Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).
