Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi
Summary
İntronları snrnas Biogenesis çeşitli hücresel bölmeler içeren karmaşık bir süreçtir. Burada, hücrenin içindeki taşımalarını izlemek için floresan etiketli snRNAs ‘ın Mikroenjeksiyonu çalışılmış.
Abstract
İntronları snrnas Biogenesis hem nükleer ve sitoplazmik aşamaları içeren karmaşık bir süreçtir ve son adım Cajal vücut denilen bir nükleer bölme oluşur. Ancak, snRNA lokalizasyonu bu subnuclear yapısına doğrudan dizileri yakın zamana kadar bilinmemektedir. Cajal vücutlarında snRNAs birikimi için önemli dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs ‘ın Mikroenjeksiyonu ve ardından hücrelerin içindeki lokalizasyonu ile çalışmaktadır. İlk olarak, snRNA silme mutantlar hazırladık, in vitro transkripsiyon için sentezlenmiş DNA şablonları ve Alexa488 ile birleştiğinde UTP varlığı ile snRNAs transkripsiyonu. Etiketli snRNAs TRITC ile konjuli 70 kDa-dextran ile karıştırıldı ve Kernel veya insan HeLa hücrelerinin sitoplazması mikroenjekte edildi. Hücreler 1 h ve sabit ve Cajal vücut Marker aytac dolaylı immünofluorescence tarafından görselleştirilmiş iken, snrnas ve dextran, hangi nükleer veya sitoplazmik enjeksiyon bir marker olarak hizmet veren, doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak gözlenmiştir. Bu yöntem, çeşitli sıraları hücrelerin içinde RNA lokalizasyonu nasıl etkilediğini verimli ve hızlı test etmek için izin verir. Burada, snRNAs ‘ın Cajal gövdesine verimli bir şekilde lokalizasyonu için SM-bağlayıcı dizisinin önemini gösteriyoruz.
Introduction
RNA birleştirme, spliceosome denilen büyük bir Ribonükleoprotein kompleksi tarafından katalizlenmiş gen ifadesinde önemli adımlardan biridir. Toplam olarak, 150 ‘ den fazla protein ve 5 küçük nükleer RNAs (snRNAs) spliceosome içine birleştirme yolu farklı aşamalarında entegre edilmiştir. U1, U2, U4, U5 ve U6 snRNAs, büyük GU-AG intron ‘larının takılmasını yapmaya katılıyor. Bu snRNAs, snRNA içeren önceden biçimlendirilmiş küçük nükleer Ribonükleoprotein parçacıkları (snRNPs), snRNA ile ilişkili yedi SM proteinleri (U6 snRNA ile ilişkilendirmek gibi-SM proteinleri) ve her snRNP için spesifik 1-12 proteinleri olan spliceosome ‘a katılır.
SnRNPs montajı sitoplazmik ve nükleer aşamaları içerir. Yeni yazılmış snRNA, yedi SM proteininden toplanan bir yüzüğü satın aldığı sitoplazmada ihraç edilir. SM halkası daha sonra snRNA ‘nın çekirdeğe yeniden ithalatı için bir sinyal olarak hizmet vermektedir. SM proteinleri ile ilişkilendirmek için başarısız arızalı snRNAs sitoplazmada korunur1. Yeni ithal snrnps ilk Cajal vücutta nerede onlar snrnp özgü proteinler karşılamak ve olgunlaşma bitirmek görünür (referans2,3‘ te gözden). Son olgunlaşma adımlarını inhibisyonu Cajal organları4,5olgunlaşmamış snrnps sekestrasyon sonuçları gösterdi. Biz son snRNP olgunlaşma snRNP özgü Protein ilavesi ve aktif snRNPs oluşumu izler kalite kontrol altında bir model önerdi. Ancak, hücrelerin doğru birleştirilen olgun ve anormal olgunlaşmamış parçacıklar arasında ayırt nasıl moleküler detayları zor kalır.
Nükleer Cajal vücutlarının hedefleme ve snRNAs birikimi için gerekli olan snRNA dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam etmeye karar verdik. Mikroenjeksiyon bir seçim yöntemidir, çünkü: 1) sentetik snRNAs ‘ların, ekstra etiket dizisinin yerleştirilmesi için az alan olan kısa RNAs ‘lar için özellikle önemli olan endojen meslektaşlarını ayırt etmek için ek bir sıralı etiket gerektirmediği; 2) biyogenesis için önemli olan dizileri analiz sağlar. Örneğin, SM dizisi SM Ring montajı için gereklidir ve çekirdek6‘ ya yeniden içe aktarabilir. SnRNAs hücrede ifade edildiğinde, SM dizisi bulunmayan snRNAs sitoplazmada bozulur ve çekirdeğin ve Cajal organları7‘ ye ulaşmaz. Ancak, SM dizisi olmadan snRNAs doğrudan çekirdeğin içine mikro enjekte edilebilir ve böylece Cajal vücut lokalizasyonu içinde SM dizisinin potansiyel bir rolü assayed.
Burada, snRNA dizilerini Cajal gövdesine5‘ e hedef almak için gerekli olan bir mikroenjeksiyon yöntemi hakkında ayrıntılı olarak tarif ediyoruz. Biz SM ve SMN bağlayıcı siteleri birlikte gerekli ve sadece snRNAs ama Cajal vücuda çeşitli kısa olmayan kodlama RNAs yerelleştirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Mikroenjeksiyon yanı sıra diğer kanıtlar dayalı, biz SM halka SM bağlayıcı site monte Cajal vücut yerelleştirme sinyali olduğunu önerdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
SnRNA lokalizasyonu için nükleer Cajal organları için önemli dizileri belirlemek için floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam. Etiketli RNAs ‘ların hızlı ve oldukça basit hazırlanması nedeniyle (PCR ile DNA şablonunun hazırlanması ve ardından in vitro transkripsiyon) yöntem, çeşitli dizilerin RNA lokalizasyonu için nasıl katkıda bulunduğunu etkili bir analiz sunar. Nispeten kısa sürede, U2 snRNA ‘nın on farklı silme veya değiştirme işlemlerini analiz edebildik (referans<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çek Bilim Vakfı (18-10035S), Ulusal sürdürülebilirlik programı ı (LO1419), kurumsal destek (RVO68378050), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ve hibe ajansı tarafından destekleniyordu. Charles Üniversitesi (GAUK 134516). Biz daha fazla ışık mikroskobu çekirdek tesisi kabul, ıMG CAS, Prag, Çek Cumhuriyeti (hibe tarafından desteklenen (Czech-Bioımaging-LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
