Summary
Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.
Abstract
As plaquetas são purificadas de sangue total para estudar as suas propriedades funcionais, que devem estar livres de glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e proteínas plasmáticas. Nós descrevemos aqui a purificação das plaquetas do sangue do rato usando o meio do inclinação Three-Fold mais iohexol relativo ao volume e à centrifugação da amostra de sangue em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A recuperação/rendimento das plaquetas purificadas foi de 18,2-38,5%, e as plaquetas purificadas encontravam-se em estado de repouso, o que não continha nenhum número significativo de RBC e WBC. As plaquetas purificadas tratadas com trombina apresentaram até 93% de ativação, indicando sua viabilidade. Nós confirmamos que as plaqueta purified são suficientemente puras usando a avaliação cytometric e microscópica do fluxo. Estas plaquetas podem ser usadas para a expressão gênica, ativação, liberação de grânulos, agregação e ensaios de aderência. Este método pode ser usado para a purificação de plaquetas do sangue de outras espécies também.
Introduction
As plaquetas são um componente do sangue que funciona como um iniciador de coagulação do sangue em resposta a danos no vaso sanguíneo. Eles se reúnem no local da lesão para ligar a parede do vaso1. As plaquetas são fragmentos de anucleato de citoplasma derivados dos megacariócitos da medula óssea a influência da Trombopoietina e entram na circulação2. Eles são considerados metabolicamente ativos e capazes de detectar o ambiente extracelular ativando cascatas de sinalização intracelular que resultam em espalhamento de plaquetas, agregação e formação de plugue hemostático1,3. Além de hemostasia/trombose e cicatrização de feridas4, as plaquetas desempenham um papel importante nas respostas inflamatórias hospedeiras, angiogênese e metastatis3,5,6,7, o 8.
As plaquetas são purificadas do sangue para estudar as suas propriedades bioquímicas e fisiológicas, que devem ser livres de outros componentes sanguíneos. Desde que os glóbulos vermelhos (RBC) e glóbulos brancos (WBC) contêm significativamente mais RNA e proteínas do que as plaquetas9,10, a presença de mesmo um pequeno número destas células pode interferir com a análise transcriptômicos e proteômica de RNA e proteínas derivadas de plaquetas. Nós encontramos que as plaqueta purified ativaram com o anticorpo da ligação da trombina tal como o anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e o anti-P-Selectin mais eficientemente do que plaquetas de sangue inteiras.
Uma vez que as plaquetas são frágeis, é importante tratar as amostras o mais suavemente possível. Se as plaquetas forem ativadas, elas liberam o conteúdo do grânulo e, em última análise, degradam. Portanto, para manter as propriedades funcionais das plaquetas intactas, é importante manter a quiescência plaquetária durante o isolamento. Vários protocolos descreveram o isolamento de plaquetas de humanos, cães, ratos e primatas não humanos por vários métodos1,10,11,12. Alguns dos métodos requerem várias etapas como a coleta de plasma rico em plaquetas por centrifugação, filtração por coluna de separação, seleção negativa de plaquetas com RBC-e anticorpo específico para WBC conjugado com grânulos magnéticos, e assim por diante, que são consome muito tempo e pode degradar as plaquetas e o seu conteúdo.
Ford e seus colegas descreveram a purificação da plaqueta do sangue humano usando o meio do iohexol11. Este método utiliza um volume semelhante de amostra de sangue e meio durante a purificação. Uma vez que os seres humanos produzem um maior volume de sangue, é relativamente fácil de purificar as plaquetas.
O iohexol é um meio inerte de gradiente de densidade universal que é livremente solúvel em água e utilizado no fracionamento de ácidos nucleicos, proteínas, polissacarídeos e nucleoproteínas13,14. Tem baixa osmolaridade e é não-tóxico, tornando-se assim um meio ideal para a purificação de células vivas intactas11. É um meio não particulado; Conseqüentemente, a distribuição das pilhas em um inclinação pode ser determinada usando o Hemocytometer, o cytometer do fluxo, ou o Espectrofotômetro. Não interfere com a maioria da reação enzimática ou química das células ou fragmentos celulares após a diluição.
O rato serve como um modelo animal importante para muitas doenças humanas15,16, 17,18. Há alguns artigos publicados que descrevem a purificação de plaquetas de camundongo19,20. No entanto, o mouse produz um volume relativamente menor de sangue, o que torna difícil para purificar as plaquetas. Se o mesmo pequeno volume de meio de gradiente e amostras de sangue é usado, a camada plaquetária não pode ser claramente separada da camada de RBC-WBC após a centrifugação. Neste artigo, nós descrevemos um método rápido e simples da purificação da plaqueta do rato com o meio do inclinação do iohexol do três-dobra mais relativo ao volume da amostra de sangue e à centrifugação de baixa velocidade. Também ativamos as plaquetas purificadas com trombina e investimos sua qualidade com citometria de fluxo e microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comumente, as plaquetas são isoladas por centrifugação de baixa velocidade que produz plasma rico em plaquetas que contém um número significativo de células sanguíneas, detritos celulares e proteínas plasmáticas que podem interferir com os ensaios e necessidades bioquímicas e fisiológicas purificação mais adicional21. Portanto, é importante usar um método rápido e simples que pode produzir plaquetas puras sem grandes contaminantes. O protocolo aqui apresentado descreve a purificaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um financiamento de start-up de Cincinnati Children ‘ s Research Foundation e uma Universidade de Cincinnati Grant Pilot translational para M.N. Gostaríamos de agradecer o Cincinnati Children ‘ s Hospital pesquisa fluxo cytometry núcleo para seus serviços.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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