Zuivering van bloedplaatjes van muis Blood
Summary
Hier, muis bloed werd verzameld in de aanwezigheid van een anti-coagulant. De bloedplaatjes werden gezuiverd door iohexol gradiënt medium met behulp van lage snelheid centrifugeren. De bloedplaatjes werden geactiveerd met trombine om te onderzoeken of ze levensvatbaar waren. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geanalyseerd door stromings Cytometry en microscopie.
Abstract
De bloedplaatjes worden gezuiverd van geheel bloed om hun functionele eigenschappen te bestuderen, die van rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), en plasmaproteïnen vrij zouden moeten zijn. We beschrijven hier zuivering van bloedplaatjes uit muis bloed met behulp van drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en centrifugeren in een swingende emmer rotor op 400 x g voor 20 min bij 20 ° c. De terugwinning/opbrengst van de gezuiverde bloedplaatjes was 18.2-38.5%, en de gezuiverde bloedplaatjes waren in een rustende staat, die geen significant aantal van RBC en WBC bevatten. De gezuiverde bloedplaatjes behandeld met trombine toonde tot 93% activering, met vermelding van hun levensvatbaarheid. We hebben bevestigd dat de gezuiverde bloedplaatjes voldoende zuiver zijn met behulp van flow flowcytometrische en microscopische evaluatie. Deze bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor genexpressie, activering, granule release, aggregatie, en adhesie assays. Deze methode kan worden gebruikt voor de zuivering van bloedplaatjes uit het bloed van andere soorten ook.
Introduction
De bloedplaatjes zijn een component van bloed dat als initiator van bloed het klonteren als reactie op schade in het bloedvat functioneert. Zij verzamelen zich op de plaats van verwonding om de schipmuur1te stoppen. Bloedplaatjes zijn anucleate fragmenten van cytoplasma afgeleid van de megakaryocytes van het beenmerg onder invloed van thrombopoietin en voer de circulatie2. Ze worden beschouwd als metabolisch actief en kunnen sensing extracellulaire omgeving door het activeren van intracellulaire signalering Cascades die resulteren in bloedplaatjes verspreiden, aggregatie, en hemostatische plug vorming1,3. Naast hemostase/trombose en wondgenezing4, bloedplaatjes spelen een belangrijke rol in de gastheer inflammatoire reacties, bloedvat, en de substatis3,5,6,7, 8.
Plaatjes worden gezuiverd van bloed om hun biochemische en fysiologische eigenschappen, die moeten vrij zijn van andere bloedbestanddelen studie. Sinds rode bloedcellen (RBC) en witte bloedcellen (WBC) bevatten aanzienlijk meer RNA en eiwitten dan bloedplaatjes9,10, de aanwezigheid van zelfs een klein aantal van deze cellen kunnen interfereren met transcriptomics en Proteomic analyses van RNA en eiwitten afkomstig van bloedplaatjes. We vonden dat gezuiverde bloedplaatjes geactiveerd met trombine BIND antilichaam, zoals anti-GPIIb/IIIa (JON/A) en anti-P-selectine efficiënter dan hele bloedplaatjes.
Aangezien bloedplaatjes kwetsbaar zijn, is het belangrijk om de monsters zo licht mogelijk te behandelen. Als de bloedplaatjes zijn geactiveerd, ze vrij hun korrel inhoud en uiteindelijk afgebroken. Daarom, om te voorkomen dat de bloedplaatjes ‘ functionele eigenschappen intact, is het belangrijk om bloedplaatjes rust te handhaven tijdens isolatie. Verschillende protocollen hebben beschreven isolatie van bloedplaatjes van de mens, hond, rat, en niet-menselijke primaat door verschillende methoden1,10,11,12. Sommige van de methoden vereisen meerdere stappen, zoals het verzamelen van bloedplaatjes-rijk plasma door centrifugeren, filtratie door scheiding kolom, negatieve selectie van bloedplaatjes met RBC-en WBC-specifieke antilichaam geconjugeerd aan magnetische kralen, en zo verder, die tijdrovende en kan afgebroken bloedplaatjes en de inhoud ervan.
Ford en zijn collega’s beschreven bloedplaatjes zuivering van menselijk bloed met behulp van iohexol medium11. Deze methode gebruikt een gelijkaardig volume van bloedsteekproef en middel tijdens reiniging. Aangezien de mens een hoger volume van bloed oplevert, is het vrij gemakkelijk om de bloedplaatjes te zuiveren.
Iohexol is een universele dichtheid gradiënt inert medium dat vrij oplosbaar is in water en gebruikt in de fractionering van nucleïnezuren, eiwitten, polysaccharide, en Nucleoproteins13,14. Het heeft een lage osmolaliteit en is niet giftig, waardoor het een ideaal medium voor de reiniging van intact levende cellen11. Het is een niet-zwevend medium; Daarom kan de verdeling van cellen in een gradiënt worden bepaald gebruikend hemocytometer, stroom cytometer, of spectrofotometer. Het interfereert niet met het merendeel van de enzymatische of chemische reactie van de cellen of cellulaire fragmenten na verdunning.
De muis fungeert als een belangrijk diermodel voor vele menselijke ziekten15,16,17,18. Er zijn een paar gepubliceerde artikelen die de zuivering van de muis plaatjes te beschrijven19,20. Echter, de muis levert een relatief kleiner volume van het bloed, waardoor het moeilijk is om bloedplaatjes te zuiveren. Als dezelfde kleine hoeveelheid gradiënt medium en bloedmonsters wordt gebruikt, kan de bloedplaatjes laag niet duidelijk worden gescheiden van RBC-WBC laag na centrifugeren. In dit artikel hebben we beschreven een snelle en eenvoudige methode van de muis bloedplaatjes zuivering met drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en lage snelheid centrifugeren. We hebben ook geactiveerd de gezuiverde bloedplaatjes met trombine en onderzocht hun kwaliteit met Flow Cytometry en microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vaak worden bloedplaatjes geïsoleerd door lage snelheid centrifuges die bloedplaatjes-rijk plasma dat een aanzienlijk aantal bloedcellen, cellulaire puin, en plasma-eiwitten die kunnen interfereren met de biochemische en fysiologische analyses en behoeften bevat verdere reiniging21. Daarom is het belangrijk om een snelle en eenvoudige methode te gebruiken die zuivere bloedplaatjes zonder belangrijke verontreinigende stoffen kan opleveren. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft de zuivering va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een start-up financiering van Cincinnati Children’s Research Foundation en een universiteit van Cincinnati pilot translationele Grant aan M.N. We willen graag de Cincinnati Children’s Hospital Research flow Cytometry core bedanken voor hun diensten.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
