Purification des plaquettes du sang de souris
Summary
Ici, le sang de la souris a été recueilli en présence d’un anti-coagulant. Les plaquettes ont été purifiées par le milieu gradient Iohexol en utilisant une centrifugation à faible vitesse. Les plaquettes ont été activées avec la thrombine pour enquêter si elles étaient viables. La qualité des plaquettes purifiées a été analysée par cytométrie en flux et microscopie.
Abstract
Les plaquettes sont purifiées du sang entier pour étudier leurs propriétés fonctionnelles, qui doivent être exemptes de globules rouges (RBC), de globules blancs (WBC) et de protéines plasmatiques. Nous décrivons ici la purification des plaquettes du sang de souris en utilisant trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et la centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La récupération/rendement des plaquettes purifiées était de 18,2-38,5%, et les plaquettes purifiées étaient dans un état de repos, ce qui ne contenait aucun nombre significatif de RBC et de WBC. Les plaquettes purifiées traitées avec la thrombine ont montré une activation jusqu’à 93%, ce qui indique leur viabilité. Nous avons confirmé que les plaquettes purifiées sont suffisamment pures en utilisant l’évaluation cytométrique et microscopique du flux. Ces plaquettes peuvent être utilisées pour l’expression génique, l’activation, la libération de granule, l’agrégation et les essais d’adhérence. Cette méthode peut être utilisée pour la purification des plaquettes du sang d’autres espèces ainsi.
Introduction
Les plaquettes sont un composant du sang qui fonctionne comme un initiateur de la coagulation sanguine en réponse aux dommages dans le vaisseau sanguin. Ils se réunissent sur le site de blessure pour brancher la paroi du navire1. Les plaquettes sont des fragments anucléés de cytoplasme dérivés des mégakaryocytes de la moelle osseuse sous l’influence de la thrombopoïétine et entrent dans la circulation2. Ils sont considérés comme métaboliquement actifs et capables de détecter l’environnement extracellulaire en activant des cascades de signalisation intracellulaires qui entraînent une propagation plaquettaire, une agrégation et une formation de prise hémostatique1,3. Outre l’hémostase/thrombose et la guérison des plaies4, les plaquettes jouent un rôle important dans les réponses inflammatoires de l’hôte, l’angiogenèse et les métastatis3,5,6,7, le 8.
Les plaquettes sont purifiées du sang pour étudier leurs propriétés biochimiques et physiologiques, qui doivent être exemptes d’autres composants sanguins. Puisque les globules rouges (RBC) et les globules blancs (WBC) contiennent significativement plus d’ARN et de protéines que les plaquettes9,10, la présence même d’un petit nombre de ces cellules peut interférer avec les analyses transcriptomiques et protéomiques de l’ARN protéines dérivées de plaquettes. Nous avons constaté que les plaquettes purifiées activées avec l’anticorps de grippage de thrombine tels que l’anti-GPIIb/IIIa (JON/A) et l’anti-P-selectin plus efficacement que les plaquettes sanguines entières.
Étant donné que les plaquettes sont fragiles, il est important de traiter les échantillons aussi légèrement que possible. Si les plaquettes sont activées, elles libèrent leur contenu de granule et finissent par se dégrader. Par conséquent, pour conserver les propriétés fonctionnelles des plaquettes intactes, il est important de maintenir la quiescence plaquettaire pendant l’isolement. Plusieurs protocoles ont décrit l’isolement des plaquettes de l’homme, du chien, du rat et du primat non humain par diverses méthodes1,10,11,12. Certaines méthodes requièrent plusieurs étapes telles que la collecte de plasma riche en plaquettes par centrifugation, la filtration par colonne de séparation, la sélection négative de plaquettes avec des anticorps spécifiques de RBC et de WBC conjugués à des billes magnétiques, et ainsi de suite, qui sont temps et peut dégrader les plaquettes et leur contenu.
Ford et ses collègues ont décrit la purification plaquettaire du sang humain en utilisant l’Iohexol Medium11. Cette méthode utilise un volume similaire d’échantillon sanguin et de milieu pendant la purification. Étant donné que les humains produisent un plus grand volume de sang, il est relativement facile de purifier les plaquettes.
L’Iohexol est un milieu inerte à gradient de densité universel qui est librement soluble dans l’eau et utilisé dans la fractionnation des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides et des nucléoprotéines13,14. Il a une faible osmolalité et est non-toxique, ce qui en fait un milieu idéal pour la purification des cellules vivantes intactes11. Il s’agit d’un milieu non particulaire; par conséquent, la distribution des cellules dans un gradient peut être déterminée à l’aide d’un hémocytomètre, d’un cytomètre de flux ou d’un spectrophotomètre. Il n’interfère pas avec la plupart des réactions enzymatiques ou chimiques des cellules ou des fragments cellulaires après dilution.
La souris sert de modèle animal important pour de nombreuses maladies humaines15,16,17,18. Il y a quelques articles publiés qui décrivent la purification des plaquettes de souris19,20. Cependant, la souris donne un volume de sang relativement plus faible, ce qui rend difficile la purification des plaquettes. Si le même petit volume de milieu de gradient et d’échantillons sanguins est utilisé, la couche plaquettaire ne peut pas être clairement séparée de la couche RBC-WBC après centrifugation. Dans cet article, nous avons décrit une méthode rapide et simple de purification plaquettaire de souris avec trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et à la centrifugation à faible vitesse. Nous avons également activé les plaquettes purifiées avec la thrombine et étudié leur qualité avec la cytométrie en flux et la microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Communément, les plaquettes sont isolées par centrifugation à basse vitesse qui donne un plasma riche en plaquettes qui contient un nombre significatif de cellules sanguines, de débris cellulaires et de protéines plasmatiques qui peuvent interférer avec les essais biochimiques et physiologiques et les besoins purification ultérieure21. Par conséquent, il est important d’utiliser une méthode rapide et simple qui peut produire des plaquettes pures sans contaminants majeurs. Le protocole p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par un financement de démarrage de la Fondation de recherche pour enfants de Cincinnati et une bourse translationnelle pilote de l’Université de Cincinnati à M.N. Nous aimerions remercier le centre de cytométrie en flux de recherche de l’hôpital pour enfants de Cincinnati pour leurs services.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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