जीन अभिव्यक्ति के कैप विश्लेषण (CAGE) MRNA 5’ends के जीनोम व्यापक मात्रात्मक मानचित्रण के लिए एक विधि है आरएनए polymerase द्वितीय प्रतिलेखन एक एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प पर शुरू साइटों पर कब्जा करने के लिए. यह कार्य एक निम्न-इनपुट (SLIC-CAGE) प्रोटोकॉल का वर्णन करता है उच्च-गुणवत्ता वाले लायब्रेरीज़ के उत्पादन के लिए कुल आरएनए की मात्रा का उपयोग कर।
जीन अभिव्यक्ति (CAGE) का कैप विश्लेषण एक विधि आरएनए पॉलिमरेज II प्रतिलेखन प्रारंभ साइटों (TSSs) के एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। TSSs की सटीक पहचान कोर प्रमोटरों की पहचान और खोज को बढ़ाती है। इसके अलावा, सक्रिय enhancers द्विदिश प्रतिलेखन दीक्षा के हस्ताक्षर के माध्यम से पता लगाया जा सकता है. यहाँ वर्णित सुपर कम इनपुट वाहक-CAGE (SLIC-CAGE) प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल है. केज प्रोटोकॉल का यह SLIC अनुकूलन कृत्रिम रूप से एक इन विट्रो लिखित आरएनए वाहक मिश्रण है कि ब्याज के नमूने में जोड़ा जाता है के उपयोग के माध्यम से आरएनए राशि में वृद्धि से आरएनए नुकसान को कम करता है, इस प्रकार कुल नैनोग्राम-मात्रा से पुस्तकालय की तैयारी को सक्षम करने आरएनए (अर्थात, हजारों कोशिकाएं)। वाहक अपेक्षित डीएनए पुस्तकालय टुकड़ा लंबाई वितरण mimics, जिससे पूर्वाग्रह है कि एक समरूप वाहक की बहुतायत के कारण हो सकता है को नष्ट करने. प्रोटोकॉल के अंतिम चरणों में, वाहक homing endonucleases के साथ गिरावट के माध्यम से निकाल दिया जाता है और लक्ष्य लायब्रेरी परिलक्षित होता है। लक्ष्य नमूना पुस्तकालय गिरावट से संरक्षित है, के रूप में homing endonuclease मान्यता साइटों लंबे हैं (18 और 27 बीपी के बीच), यूकैरियोटिक जीनोम में उनके अस्तित्व की संभावना बहुत कम कर रही है. अंतिम परिणाम अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए तैयार एक डीएनए पुस्तकालय है। प्रोटोकॉल में सभी चरणों, अनुक्रमण करने के लिए, 6 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है. वाहक तैयारी एक पूरा काम दिन की आवश्यकता है; हालांकि, इसे बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रखा जा सकता है। एक बार अनुक्रम, पढ़ता जीनोम व्यापक एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प TSSs प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जा सकता है. TSSs कोर प्रमोटर या बढ़ाने की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जीन विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान. प्रमोटरों के लिए एकत्रित हो जाने के बाद, डेटा का उपयोग 5’केंद्रित अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए भी किया जा सकता है।
जीन अभिव्यक्ति का कैप विश्लेषण (CAGE) एक विधि है जो आरएनए पॉलिमरेज II प्रतिलेखन प्रारंभ स्थलों (TSSs)1के एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प जीनोम-वाइड मैपिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। इसकी मात्रात्मक प्रकृति भी 5’अंत केंद्रित अभिव्यक्ति रूपरेखा की अनुमति देता है. टीएसएसएस (लगभग 40 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम) के आस-पास के क्षेत्र मुख्य प्रवर्तक हैं और भौतिकस्थान का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां आरएनए पॉलिमरेज II और सामान्य प्रतिलेखन कारक बांधते हैं (पहले 2,3) की समीक्षा की जाती है। TSSs के सटीक स्थानों पर जानकारी कोर प्रमोटर खोज के लिए और प्रमोटर गतिशीलता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, के रूप में सक्रिय enhancers द्विदिश प्रतिलेखन के हस्ताक्षर प्रदर्शन, CAGE डेटा भी बढ़ाने की खोज और बढ़ाने गतिशीलता4की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CAGE पद्धति हाल ही में अपने व्यापक आवेदन और इस तरह के ENCODE5,modenCODE6,और FANTOM परियोजनाओं7के रूप में उच्च प्रोफ़ाइल अनुसंधान परियोजनाओं में उपयोग के कारण लोकप्रियता में वृद्धि हुई है. इसके अलावा, टीएसएस जानकारी भी स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक भेद करने के लिए महत्वपूर्ण साबित हो रहा है, के रूप में रोग विशेष TSSs नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 8.
हालांकि TSS मानचित्रण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं (केज, RAMPAGE, STRT, नैनोCAGE, नैनोCAGE-XL, ओलिगो-कैपिंग), हम और दूसरों को हाल ही में पता चला है कि CAGE झूठी सकारात्मक की कम से कम संख्या के साथ सच TSS पर कब्जा करने के लिए सबसे निष्पक्ष तरीकाहै 9 , 10. हाल ही में CAGE प्रोटोकॉल, NAnT-iCAGE11,TSS प्रोफाइलिंग के लिए सबसे निष्पक्ष प्रोटोकॉल है, क्योंकि यह प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर के लिए छोटे टैग करने के लिए टुकड़े काटने से बचा जाता है और पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग नहीं करता है। NANT-iCAGE प्रोटोकॉल की एक सीमा शुरू सामग्री की एक बड़ी राशि के लिए आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए कुल आरएनए के 5 डिग्री)। विशिष्ट, जैविक रूप से प्रासंगिक प्रश्नों का उत्तर देने के लिए, प्रारंभिक सामग्री की इतनी उच्च मात्रा प्राप्त करना अक्सर असंभव होता है (उदाहरण के लिए, FACS-sorted कोशिकाओं या प्रारंभिक भ्रूण चरणों के लिए)। अंत में, अगर NANT-iCAGE सफल होता है, डीएनए पुस्तकालय सामग्री के केवल 1-2 एनजी प्रत्येक नमूने से उपलब्ध है, जिससे प्राप्त अनुक्रमण गहराई सीमित.
कुल आरएनए के केवल नैनोग्राम का उपयोग करके TSS प्रोफाइलिंग को सक्षम करने के लिए, हमने हाल ही में सुपर-कम इनपुट कैरियर-CAGE10 (SLIC-CAGE, चित्र1) विकसित किया है। SLIC-CAGE उच्च जटिलता पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए कुल आरएनए के केवल 10 एनजी की आवश्यकता है। हमारे प्रोटोकॉल ध्यान से डिजाइन सिंथेटिक आरएनए वाहक ब्याज की आरएनए करने के लिए आरएनए सामग्री की कुल 5 डिग्री ग्राम प्राप्त करने के लिए जोड़ा पर निर्भर करता है. सिंथेटिक वाहक लंबाई वितरण में लक्ष्य डीएनए पुस्तकालय mimics संभावित पूर्वाग्रहों कि अतिरिक्त में समरूप अणुओं के कारण हो सकता है से बचने के लिए. वाहक का अनुक्रम दो कारणों से एस्चेरीचिया कोली ल्यूसिल-tRNA सिंथेटेज जीन (तालिका 1) के अनुक्रम पर आधारित है। सबसे पहले, अंतिम पुस्तकालय में वाहक के किसी भी बचे हुए, भले ही अनुक्रम, एक यूकैरियोटिक जीनोम के लिए नक्शा नहीं होगा. दूसरा, के रूप में ई. कोलाई एक मध्यरागी प्रजाति है, इसके गृह व्यवस्था जीन SLIC-CAGE के लिए उपयुक्त तापमान रेंज के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. वाहक अनुक्रम भी वाहक आरएनए अणुओं से व्युत्पन्न डीएनए के विशिष्ट गिरावट की अनुमति देने के लिए समापन endonuclease मान्यता साइटों के साथ एम्बेडेड है. लक्ष्य, नमूना व्युत्पन्न पुस्तकालय बरकरार रहता है, के रूप में homing endonuclease मान्यता साइटों लंबे हैं (मैं-CeuI – 27 bp; I-SceI – 18 bp) और सांख्यिकीय रूप से यूकैरियोटिक जीनोम में पाए जाने की संभावना नहीं है। वाहक की विशिष्ट गिरावट और आकार बहिष्करण द्वारा टुकड़े को हटाने के बाद, लक्ष्य पुस्तकालय पीसीआर प्रवर्धित और अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए तैयार है। प्रारंभिक आरएनए राशि (1-100 एनजी) के आधार पर, 13-18 पीसीआर प्रवर्धन चक्र के बीच की आवश्यकता होने की उम्मीद है। प्रत्येक नमूना प्रति डीएनए की अंतिम राशि 5-50 एनजी के बीच होती है, जो बहुत गहरी अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री देती है। कुल आरएनए के केवल 1-2 एनजी का उपयोग करते समय, सही TSSका पता लगाया जा सकता है; हालांकि, पुस्तकालयों कम जटिलता के होने की उम्मीद कर रहे हैं. अंत में, के रूप में SLIC-CAGE nANT-iCAGE प्रोटोकॉल11पर आधारित है, यह अनुक्रमण से पहले अप करने के लिए आठ नमूनों के मल्टीप्लेक्सिंग सक्षम बनाता है।
सफल SLIC-CAGE पुस्तकालय की तैयारी के लिए, यह नमूना अधिशोषण के कारण नमूना हानि को रोकने के लिए कम बाध्यकारी युक्तियाँ और ट्यूब का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. सुपरनेंट की पुनर्प्राप्ति से संबंधित सभी चरणों में, पूरे नमूना मात्रा को पुनर्प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल एकाधिक चरण है, के रूप में निरंतर नमूना हानि असफल लायब्रेरी के लिए लीड करेगा।
यदि CAGE (nANT-iCAGE) नियमित रूप से नहीं किया गया है, यह विभिन्न इनपुट मात्रा के साथ SLIC-CAGE परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है (10 एनजी, 20 एनजी, 50 एनजी, 100 एनजी, 200 एनजी) एक ही कुल आरएनए नमूना के और NANT-iCAGE पुस्तकालयों कि आरएनए कुल के 5 डिग्री का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं की तुलना करें। यदि nAnT-iCAGE लायब्रेरी असफल है (प्रति नमूना प्राप्त डीएनए लायब्रेरी के 0.5-1 ng से कम), SLIC-CAGE काम करने के लिए संभावना नहीं है, और नमूना हानि को कम से कम करने की आवश्यकता है।
उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों को सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम जो अकेप्ड अवक्रमित आरएनए या आरएनए से रहित है, अनुभाग 7 में वर्णित कैप-ट्रैपिंग है। यह अत्यधिक महत्वपूर्ण है कि streptavidin मोती अच्छी तरह से धोने बफ़र्स में resuspended रहे हैं और धोने बफ़र्स अगले धोने कदम या cDNA के हल करने के लिए जारी रखने से पहले हटा रहे हैं.
वाहक अवक्रमण के पहले दौर के बाद QPCR से परिणाम adaptor-f1 और carrier-f1 प्राइमर के उपयोग के बीच कोई अंतर नहीं दिखाते हैं, तो प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए अभी भी अनुशंसित है। वाहक अवक्रमण के दूसरे दौर के बाद, Ct मानों में अंतर पांच से कम है, तो वाहक अवक्रमण के तीसरे दौर की सिफारिश की है। हम आवश्यक गिरावट का एक तीसरा दौर कभी नहीं मिला है, और अगर ऐसा होता है, यह homing endonuclease शेयरों को बदलने की सिफारिश की है.
पीसीआर प्रवर्धन के अतिरिक्त दौर प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा जा सकता है यदि प्राप्त पुस्तकालय की अंतिम राशि अनुक्रमण के लिए पर्याप्त नहीं है। पीसीआर प्रवर्धन तो अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री उपज के लिए आवश्यक प्रवर्धन चक्र की न्यूनतम संख्या के साथ सेट किया जा सकता है, आकार चयन में बचा नहीं जा सकता है कि खाते में नमूना हानि लेने. शुद्धि या आकार चयन SPRI चुंबकीय मोती का उपयोग कर तो प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक सभी छोटे (lt;200 bp) टुकड़े हटा रहे हैं (यदि आवश्यक हो, नमूना अनुपात के लिए 0.6:1 मोती का उपयोग करें), और पुस्तकालय Picogreen का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए.
पुस्तकालयों एकल अंत या युग्मित अंत मोड में अनुक्रम किया जा सकता है. युग्मित अंत अनुक्रमण का उपयोग करना, प्रतिलिपि isoforms के बारे में जानकारी प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, के रूप में रिवर्स प्रतिलेखन एक यादृच्छिक प्राइमर का उपयोग किया जाता है (TCT-N6, N6 एक यादृच्छिक hexamer जा रहा है), अनुक्रम से जानकारी 3′-अंत अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (UMI) पीसीआर डुप्लिकेट पतन. पीसीआर प्रवर्धन चक्र की एक मध्यम संख्या के रूप में प्रयोग किया जाता है (अप करने के लिए 18), UMIs का उपयोग पहले अनावश्यक पाया गया है.
प्रोटोकॉल के कोर के रूप में nAnT-iCAGE11पर निर्भर करता है, SLIC-CAGE आठ बारकोड का उपयोग करता है। इसलिए, आठ से अधिक नमूने multiplexing वर्तमान में समर्थित नहीं है। इसके अलावा, दोनों SLIC-CAGE और NANT-iCAGE 200 बीपी से कम RNAs पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, के रूप में प्रोटोकॉल AMPure XP मोती के साथ आकार बहिष्कार के माध्यम से linkers और PCR कलाकृतियों को दूर करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं.
SLIC-CAGE कुल आरएनए सामग्री के नैनोग्राम का उपयोग कर प्रतिलेखन दीक्षा शुरू साइटों मानचित्रण के लिए केवल निष्पक्ष कम-इनपुट एकल-न्यूक्लिओटाइड संकल्प विधि है। वैकल्पिक विधियाँ कैप-ट्रैपिंग के बजाय बारकोड कैप्ड आरएनए के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस की टेम्पलेट स्विचिंग गतिविधि पर निर्भर करती हैं (उदा., NanoCAGE15 और NanoPARE16)। टेम्पलेट स्विचन के कारण, इन विधियों में टीएसएस का पता लगाने में अनुक्रम-विशिष्ट पूर्वाग्रहों का प्रदर्शन होता है, जिससे झूठी सकारात्मक टीएसएसएस की संख्या में वृद्धि हुई है और वास्तविक टीएसएसएस9,10की संख्या में कमी आई है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को बी एल और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) कोर फंडिंग (एमसी-A652-5QA10) को सम्मानित वेलकम ट्रस्ट अनुदान (106954) द्वारा समर्थित किया गया था। एन सी EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (EMBO ALTF 1279-2016) द्वारा समर्थित किया गया था; ई. पी. चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन द्वारा समर्थित किया गया था; बी एल चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन (एमसी यूपी 1102/
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 59304-100ML-F | Used in RNAclean XP purification. |
3' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
5' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
Agencourt AMPure XP, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Purification of DNA |
Agencourt RNAClean XP Kit | Beckman Coulter | A63987 | Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps. |
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips | Axygen (available through Corning) | PCR-0208-CP-C | Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes). |
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps | Axygen (available through Corning) | PCR-02CP-C | Caps for PCR plates. |
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube | Axygen (available through Corning) | MCT-150-L-C | Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration. |
Axygen 96 well no skirt PCR microplate | Axygen (available through Corning) | PCR-96-C | Low-binding PCR plates – have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples |
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits | Agilent | To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used) | |
Biotin (Long Arm) Hydrazide | Vector laboratories | SP-1100 | Biotinylation/tagging |
Cutsmart buffer | NEB | Restriction enzyme buffer | |
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | NEB | M0259S | Second strand synthesis |
DNA Ligation Kit, Mighty Mix | Takara | 6023 | Used for 5' and 3'-linker ligation |
dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR) |
Dynabeads M-270 Streptavidin | Invitrogen | 65305 | Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used. |
DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12321D | Magnetic stand for 1.5 ml tubes – used to prepare Streptavidin beads. |
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | ThermoFisher Scientific | 12027 | Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) – used with cut plates to contain 2 x 8 wells. |
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 51976-500ML-F | Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used. |
Exonuclease I (E. coli) | NEB | M0293S | Leftover primer degradation |
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS | NEB | B7025S | agarose gel loading dye |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | Kit for carrier in vitro transcription |
Horizontal electrophoresis apparatus | purification of carrier DNA templates from agarose gels | ||
I-Ceu | NEB | R0699S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
I-SceI | NEB | R0694S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x) | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK2601 | PCR mix for target library amplification |
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK4600 | qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles |
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µl, 1-20 µl, 20-200 µ) | Gilson | Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss. | |
Microplate reader | For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste. | ||
nuclease free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | Or any nuclease (DNase and RNase) free water |
PCR thermal cycler | incubation steps and PCR amplficication | ||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F530S | DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase) |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Purification of carrier PCR templates from agarose gels. |
qPCR machine | determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation | ||
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher Scientific | P11495 | Used to measure final library concentration – recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit. |
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | NEB | N0551S | DNA ladder |
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N0550S | DNA ladder |
Ribonuclease H | Takara | 2150A | Digestion of RNA after cap-trapping. |
RNase ONE Ribonuclease | Promega | M4261 | Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA. |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription. |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping |
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free | VWR | AAJ63669-AK | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution |
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution | ||
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | Oxidation of vicinal diols |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719390-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719463-1000EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719412-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719447-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
SpeedVac Vacuum Concentrator | concentrating samples in various steps to lower volume | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | Used for reverse transcription (1st CAGE step) |
Trehalose/sorbitol solution | Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5 | 1 M solution, DNase and RNase free | ||
tRNA (20 mg/mL) | tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
UltraPure Low Melting Point Agarose | ThermoFisher Scientific | 16520050 | Or any suitable pure low-melt agarose. |
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) | Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific) | 78390500UN | |
USER Enzyme | NEB | M5505S | Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme |
Vaccinia Capping System | NEB | M2080S | Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules |
Wash buffer A | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
Wash buffer B | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
Wash buffer C | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. |