Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro
Summary
Il metodo di localizzazione dell’immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.
Abstract
Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono strumenti importanti per il rilevamento, la diagnosi e il trattamento del cancro. Essi sono utilizzati per svelare il ruolo delle proteine nella tumorigenesi, possono essere diretti a biomarcatori tumorali che consentono il rilevamento e la caratterizzazione del tumore, e possono essere utilizzati per la terapia del cancro come mAbs o coniugati anticorpale-farmaco per attivare le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule eftori immunitarie, per inibire le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule efiloriche immunitarie, per inibire le cellule echeologiche immunitarie, per inibire le cellule ebrasive immunitarie vie di segnalazione, o uccidere direttamente le cellule che trasportano l’antigene specifico. Nonostante i progressi clinici nello sviluppo e nella produzione di nuovi e altamente specifici mAb, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere compromesse dalla complessità e dall’eterogeneità del microambiente tumorale. Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l’interazione del coniugato basato sugli anticorpi con il microambiente tumorale vivente. Qui, descriviamo in Vivo immunofluorescenza localizzazione (IVIL) come un nuovo approccio per studiare le interazioni di terapie e diagnostica basate su anticorpi nelle condizioni fisiologiche e patologiche in vivo. In questa tecnica, un anticorpo terapeutico o diagnostico specifico dell’antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo e localizzato ex vivo con un anticorpo secondario in tumori isolati. IVIL, quindi, riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci anticorpi e agenti di targeting. Due applicazioni IVIL sono descritte valutando la biodistribuzione e l’accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per l’imaging molecolare del cancro al seno. Questo protocollo permetterà agli utenti futuri di adattare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.
Introduction
Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi legocoproteine (circa 150 kDa) della superfamiglia immunoglobulina che sono secreti dalle cellule B e hanno una funzione primaria nel sistema immunitario per identificare e inibire la funzione biologica di, o segnare per distruzione, patogeni batterici o virali, e può riconoscere l’espressione anomala delle proteine sulle cellule tumorali1. Gli anticorpi possono avere un’affinità estremamente elevata con i loro epitopi specifici fino alle concentrazioni di femtomolare, rendendoli strumenti molto promettenti in biomedicina2. Con lo sviluppo della tecnologia dell’ibrido da parte di Milstein e del Kohler (premiato con il Premio Nobel nel 1984), la produzione di mAbs divenne possibile3 . Più tardi, mAbs umani sono stati generati utilizzando la tecnologia di visualizzazione fago o ceppi di topi transgenici e ha rivoluzionato il loro uso come nuovi strumenti di ricerca e terapie4,5.
Il cancro è un problema di salute mondiale e una delle principali cause di morte, creando la necessità di nuovi approcci per la prevenzione, la scoperta e la terapia6. Ad oggi, gli mAb hanno permesso l’estricazione del ruolo dei geni e delle loro proteine nella tumorigenesi e quando sono diretti contro i biomarcatori del cancro, possono consentire la rilevazione e la caratterizzazione del tumore per la stratificazione del paziente. Per la terapia del cancro, vengono sviluppati i coniugati bispecifici, i coniugati anticorpo-farmaco e i frammenti di anticorpi più piccoli come terapie, e per la somministrazione mirata di farmaci per migliorare l’efficacia terapeutica7. Inoltre, gli anticorpi servono per il biomarcatore mirato di agenti di contrasto per le modalità di imaging molecolare come la chirurgia a fluorescenza, l’imaging fotoacustico (PA), l’imaging molecolare degli ultrasuoni (US) e l’emissione di positroni clinicamente utilizzati tomografia (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singoli fotoni (SPECT)8. Infine, gli anticorpi possono essere utilizzati anche come agenti tenetici che consentono la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio della risposta per le terapie mirate9. Pertanto, nuovi mAbs stanno cominciando a svolgere un ruolo fondamentale nella diagnosi, diagnosi, e trattamento del cancro.
Nonostante i progressi critici nello sviluppo e nella produzione di mAb nuovi e altamente specifici, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere rese inefficaci a causa della complessità dell’ambiente tumorale. Le interazioni anticorpali dipendono dal tipo di epitopo, cioè,se è lineare o conformazionale10. Oltre al riconoscimento degli antigeni, gli anticorpi devono superare le barriere naturali come le pareti del vaso, le membrane basali e lo stroma tumorale per raggiungere le cellule bersaglio che esprimono l’antigene. Gli anticorpi interagiscono con il tessuto non solo attraverso il dominio di legame dell’antigene a frammento variabile (Fab), ma anche attraverso il costante frammento cristallino (Fc) che porta ulteriormente alle interazioni fuori sede11. Il targeting è complicato anche dall’espressione eterogenea dei marcatori tumorali in tutta la massa tumorale e l’eterogeneità nella vascolarizzazione tumorale e dal sistema linfatico12,13. Inoltre, il microambiente tumorale è composto da fibroblasti associati al cancro che supportano le cellule tumorali, le cellule immunitarie tumorali che sopprimono le reazioni immunitarie anti-tumorali e l’endotelio tumorale che supporta il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive, tutti che interferiscono con la penetrazione, la distribuzione e la disponibilità di terapie o diagnostica basate su anticorpi. Nel complesso, queste considerazioni possono limitare l’efficacia terapeutica o diagnostica, ridurre la risposta al trattamento, e può provocare resistenza al tumore.
Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l’interazione del coniugato basato sugli anticorpi all’interno del microambiente tumorale. Attualmente, negli studi preclinici, l’espressione dei marcatori nei modelli di ricerca sul tumore viene analizzata ex vivo per colorazione immunofluorescenza (IF) delle sezioni tumorali14. La colorazione SE standard viene eseguita con anticorpi specifici del marcatore primario che vengono poi evidenziati da anticorpi secondari fluorescenti etichettati su fette di tessuto tumorale ex vivo che sono stati isolati dall’animale. Questa tecnica evidenzia la posizione statica del marcatore al momento della fissazione dei tessuti e non fornisce informazioni su come le terapie o la diagnostica basati su anticorpi potrebbero distribuire o interagire in condizioni fisiologiche. L’imaging molecolare di PET, SPECT, US e PA può fornire informazioni sulla distribuzione dell’agente di contrasto coniugato con anticorpi nei modelli preclinici viventi8,15. Poiché queste modalità di imaging non sono invasive, è possibile eseguire studi longitudinali e raccogliere dati sensibili al tempo con un numero minimo di animali per gruppo. Tuttavia, questi approcci di imaging molecolare non invasivo non sono abbastanza sensibili e non hanno una risoluzione sufficiente per la localizzazione della distribuzione degli anticorpi a livello cellulare. Inoltre, le caratteristiche fisiche e biologiche dell’anticorpo primario possono essere drasticamente modificate dalla coniugazione di un agente di contrasto16.
Al fine di prendere in considerazione le condizioni fisiologiche e patologiche in vivo di come le terapie e la diagnostica basate su anticorpi interagiscono all’interno dell’ambiente tumorale e per ottenere una distribuzione cellulare e persino subcellulare ad alta risoluzione profili di anticorpi non coniugati, proponiamo un approccio IF, ritenuto In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), in cui l’anticorpo specifico dell’antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo. La terapia o diagnostica basata su anticorpi, agendo come anticorpo primario, circola nei vasi sanguigni funzionali e si lega alla proteina bersaglio nell’ambiente tumorale vivo e altamente accurato. Dopo l’isolamento dei tumori in vivo con l’anticorpo primario, viene utilizzato un anticorpo secondario per localizzare i coniugati degli anticorpi accumulati e conservati. Questo approccio è simile a un approccio di istologia IF descritto in precedenza iniettando anticorpi fluorescenti17. Anche se qui, l’uso di anticorpi non coniugati evita un potenziale cambiamento nelle caratteristiche di biodistribuzione indotte dalla modifica dell’anticorpo. Inoltre, l’applicazione ex vivo dell’anticorpo secondario fluorescente evita una possibile perdita di segnale di fluorescenza durante la raccolta e l’elaborazione dei tessuti e fornisce amplificazione dell’intensità del segnale di fluorescenza. Il nostro approccio di etichettatura riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci basati su anticorpi e agenti mirati e può fornire importanti informazioni per lo sviluppo di nuovi agenti diagnostici e terapeutici.
In questo articolo, descriviamo due applicazioni del metodo IVIL applicate in studi precedenti che studiano la biodistribuzione e l’accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per gli approcci di imaging molecolare per il rilevamento del cancro al seno. In primo luogo, la biodistribuzione di un controcorpo a raggi infrarossi vicino a un anticorpo (anticorpo anti-B7-H3 legato al colorante a fluorescenza infrarossa vicino, al verde indocianina, B7-H3-ICG) e all’agente di controllo isotipo (Iso-ICG) per la fluorescenza e la fotoacustica molecolare l’imaging è esplorato18. Il metodo di questa applicazione è descritto nel protocollo. Successivamente, i risultati della biodistribuzione di un anticorpo conformazionalmente sensibile al netrin-1, in genere non rilevabili con l’imaging TRADIZIONALE IF, utilizzato con imaging molecolare ad ultrasuoni, vengono quantificati e presentati nei risultati rappresentativi19. Al termine di questo documento di protocollo, i lettori dovrebbero sentirsi a proprio agio nell’adottare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo ha diversi passaggi critici e richiede potenziali modifiche per garantire una corretta implementazione. In primo luogo, il dosaggio e la tempistica dell’iniezione endovenosa anticorpo/anticorpo devono essere adattati all’applicazione specifica. Generalmente, dosaggi dovrebbero essere utilizzati che sono coerenti con come l’anticorpo coniugato sarà in genere utilizzato, cioè, dosaggi corrispondenti dell’anticorpo terapeutico o agente di contrasto basato su anticorpi. Inoltre, i tempi della raccolta dei tes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) per le discussioni e l’uso delle attrezzature. Ringraziamo il dottor Juergen K. Willmann per il suo mentore. Questo studio è stato sostenuto da NIH R21EB022214 grant (KEW), NIH R25CA118681 training grant (KEW) e NIH K99EB023279 (KEW). Lo Stanford Neuroscience Microscopy Service è stato supportato da NIH NS069375.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. 암 연구학. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. 암 연구학. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
