Caractérisation au niveau moléculaire à l'aide d'approches biochimiques robustes d'une nouvelle protéine Kinase
Summary
Nous avons caractérisé une nouvelle protéine de kinase utilisant des approches biochimiques robustes : analyse de blot occidental avec un anticorps spécifique consacré sur différentes lignées et tissus de cellules, interactions par des expériences de coimmunoprecipitation, activité de kinase détectée par l’ouest Blot à l’aide d’un anticorps spécifique au phospho et par l’étiquetage ATP de32P.
Abstract
Le séquençage complet du génome entier a permis d’identifier de nombreux cadres de lecture ouverts (ORF) fournissant de nombreuses protéines potentielles. Ces protéines peuvent avoir des rôles importants pour la cellule et peuvent démêler de nouveaux processus cellulaires. Parmi les protéines, les kinases sont des acteurs majeurs car elles appartiennent à des voies de signalisation cellulaire et ont la capacité d’allumer ou d’éteindre de nombreux processus cruciaux pour le sort de la cellule, tels que la croissance cellulaire, la division, la différenciation, la motilité et la mort.
Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur une nouvelle protéine kinase potentielle, LIMK2-1. Nous avons démontré son existence par Western Blot à l’aide d’un anticorps spécifique. Nous avons évalué son interaction avec une protéine régulatrice en amont à l’aide d’expériences de coimmunoprécipitation. La coimmunoprécipitation est une technique très puissante capable de détecter l’interaction entre deux protéines cibles. Il peut également être utilisé pour détecter de nouveaux partenaires d’une protéine d’appât. La protéine d’appât peut être purifiée soit par l’intermédiaire d’une étiquette conçue à sa séquence ou par l’intermédiaire d’un anticorps le ciblant spécifiquement. Ces complexes protéiques peuvent ensuite être séparés par SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) et identifiés à l’aide de la spectrométrie de masse. LimK2-1 immunoprécicé a également été utilisé pour tester son activité kinase in vitro par l’étiquetage ATP de32P. Cet exemple bien établi peut utiliser de nombreux substrats différents, et des versions mutées de l’appât peuvent être utilisées pour évaluer le rôle de résidus spécifiques. Les effets des agents pharmacologiques peuvent également être évalués puisque cette technique est à la fois très sensible et quantitative. Néanmoins, la gestion de la radioactivité exige une prudence particulière. L’activité de Kinase peut également être évaluée avec des anticorps spécifiques ciblant le groupe de phospho de l’acide aminé modifié. Ces types d’anticorps ne sont pas disponibles dans le commerce pour tous les résidus modifiés par le phospho.
Introduction
Pendant de nombreuses décennies, de nombreuses voies de signalisation ont été élucidées et leur implication dans des processus cellulaires cruciaux tels que la division cellulaire, la différenciation, la motilité, la mort cellulaire programmée, l’immunité et la neurobiologie, a été démontrée. Les kinases jouent un rôle important dans ces voies de signalisation car elles régulent souvent finement leur activation ou leur inactivation et font partie de complexes polyvalents transitoires qui répondent aux stimuli externes1,2,3. La mutation et la dysrégulation des kinases conduisent souvent à des maladies chez l’homme, et ils sont donc devenus l’une des cibles les plus importantes de drogue au cours des quarante dernières années4.
Dans ce contexte, il est important de pouvoir détecter l’interaction kinase avec leurs régulateurs en amont ou leurs substrats en aval et d’identifier de nouveaux partenaires. La purification d’affinité et l’immunoprécipitation sont des techniques très puissantes pour l’isolement des complexes protéiques5. La protéine d’appât ou la kinase peut être étiquetée avec une séquence spécifique de peptide permettant l’utilisation des perles commerciales covalently couplées avec des anticorps ciblant le peptide. Ce matériau permet une haute reproductibilité dans les expériences6,7,8. Les protéines endogènes peuvent également être immunoprécipitées à l’aide d’anticorps ciblant directement la protéine d’appât. Les anticorps peuvent être reliés entre les protéines A ou protéines G perles d’agarose ou tout simplement incubé avec ces perles avant d’ajouter du lysate. Les tampons de lysis doivent être optimisés pour permettre la solubilité des protéines sans perdre l’interaction et pour éviter la dégradation des protéines. Un inconvénient majeur de cette approche est que l’interaction est détectée sur la lyse cellulaire; par conséquent, les interactions transitoires ou faibles, ainsi que celles qui nécessitent un contexte subcellulaire peuvent être manquées. D’autres techniques peuvent être utilisées pour travailler directement dans la cellule, comme l’analyse de la liaison de proximité (ApL)9, la purification in vivo d’affinités croisées (XAP)10, le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) ou l’énergie de résonance de La Transfert (FRET)11,12. En outre, l’immunoprécipitation n’est pas appropriée pour déterminer les constantes thermodynamiques de la liaison, pour lesquelles des techniques physiques telles que la résonance plasmon de surface, la calorimétrie de titration isothermale ou la thermophoresis à microéchelle sont nécessaires 13,14.
L’activité kinase peut être évaluée à l’aide de plusieurs techniques. Ici, nous nous sommes concentrés sur les anticorpsspécifiques au phospho et l’étiquetage in vitro de l’ATP (Adenosine TriPhosphate). Les anticorps spécifiques au phospho ciblent la modification du phosphate d’un résidu particulier dans une protéine. Ils peuvent être utilisés dans Western Blot ou ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) après la lyse cellulaire, pour l’immunohistochimie, et aussi sur les cellules intactes en utilisant la cytométrie du flux ou l’immunofluorescence. Leurs inconvénients peuvent inclure leur manque de spécificité, qui peut être évalué à l’aide d’une version mutée de la protéine cible, et leur absence de commerce disponible pour toutes les protéines. L’étiquetageATP in vitro est une méthode très robuste, bien établie et très sensible15. Des protéines immunoprécipitées ou recombinantes peuvent être utilisées, et différents substrats peuvent être testés. Les effets des médicaments peuvent également être évalués car cette méthode est quantitative. Son principal inconvénient est que la radioactivité associée à l’approche nécessite une manipulation avec prudence. D’autres méthodes sont également possibles sur la base de la mesure des substrats peptidiques fluorescents ou luminescents et en tirant parti des propriétés fluorescentes/luminescentes altérées lors de la phosphorylation. Ces méthodes permettent également un débit élevé, ce qui est nécessaire, par exemple, dans le dépistage de molécules qui peuvent être des inhibiteurs potentiels de la kinase cible. En effet, les kinases représentent l’une des plus grandes catégories de cibles pharmaceutiques poursuivies par les sociétés pharmaceutiques16.
Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la protéine LIMK2-1 (LIMK2-1 signifie Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoforme 2-1). La protéine LIMK2 kinase a été décrite pour la première fois en 199517. Trois isoformes de LIMK2 sont produits par épissage alternatif : LIMK2a, LIMK2b et LIMK2-1. À l’heure actuelle, LIMK2-1 n’a été décrit qu’au niveau de l’ARNm dans une seule étude18. Ici, nous caractérisons cette nouvelle protéine kinase potentielle au niveau moléculaire en utilisant des approches biochimiques robustes. Tout d’abord, nous démontrons que LIMK2-1 est en effet synthétisé. Semblable à ses deux homologues, LIMK2a et LIMK2b, il interagit avec la kinase ROCK en amont (protéine kinase associée à Rho). Nous montrons LIMK2-1 a une activité kinase sur myéline protéine de base (MBP), mais pas sur la cofiline, le substrat canonique de kinases LIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons utilisé des outils biochimiques robustes pour caractériser au niveau moléculaire une nouvelle protéine, LIMK2-1, considérée comme une kinase basée sur sa séquence et sur ses homologs, LIMK2a et LIMK2b20.
Tout d’abord, nous avons démontré l’existence de LIMK2-1 au niveau des protéines en utilisant l’analyse Western Blot avec un anticorps spécifique. Par la suite, nous avons évalué son interaction avec la kinase ROCK1 en amont, qui est connue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par La Ligue contre le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, et la Région Centre Val de Loire. Un grand merci à Aurélie Cosson et Déborah Casas pour les données de cytométrie des flux, et à Keyron Hickman-Lewis pour la relecture approfondie du manuscrit.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
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