एक नई Kinase प्रोटीन के मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर विशेषता
Summary
हम मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर एक नया kinase प्रोटीन की विशेषता: विभिन्न सेल लाइनों और ऊतकों पर एक समर्पित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण, coimmunosiactivity प्रयोगों द्वारा बातचीत, kinase गतिविधि पश्चिमी द्वारा पता लगाया फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके और [32पी] एटीपी लेबलिंग द्वारा ब्लॉट।
Abstract
व्यापक पूरे जीनोम अनुक्रमण कई ओपन रीडिंग फ्रेम्स (ORFs) कई संभावित प्रोटीन प्रदान की पहचान की है. इन प्रोटीन सेल के लिए महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है और नई सेलुलर प्रक्रियाओं को जानने सकता है. प्रोटीन के अलावा, kinases प्रमुख अभिनेता हैं के रूप में वे सेल संकेतन रास्ते के हैं और पर या सेल के भाग्य के लिए महत्वपूर्ण कई प्रक्रियाओं बंद स्विच करने की क्षमता है, जैसे सेल विकास, विभाजन, भेदभाव, गतिशीलता, और मौत.
इस अध्ययन में, हम एक नई संभावित kinase प्रोटीन, LIMK2-1 पर ध्यान केंद्रित किया. हम एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी ब्लॉट द्वारा अपने अस्तित्व का प्रदर्शन किया. हम coimmunoprecipitation प्रयोगों का उपयोग कर प्रोटीन को विनियमित करने के लिए एक अपस्ट्रीम के साथ अपनी बातचीत का मूल्यांकन किया. Coimmunoveriveriveriveris एक बहुत शक्तिशाली दो लक्ष्य प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने में सक्षम तकनीक है. यह भी एक चारा प्रोटीन के नए भागीदारों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चारा प्रोटीन या तो एक टैग के माध्यम से अपने अनुक्रम के लिए इंजीनियर शुद्ध किया जा सकता है या विशेष रूप से इसे लक्षित एक एंटीबॉडी के माध्यम से. इन प्रोटीन परिसरों तो एसडीएस-पेज (सोडियम Dodecyl सल्फेट PolyAcrylamide जेल) द्वारा अलग किया जा सकता है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर की पहचान की. इम्यूनोप्रिसिपेटेड LIMK2-1 का उपयोग इन विट्रो में अपनी काइनेज़ गतिविधि का परीक्षण करने के लिए भी किया जाता था [32P] एटीपी लेबलिंग। यह अच्छी तरह से स्थापित परख कई अलग अलग substrates का उपयोग कर सकते हैं, और चारा के उत्परिवर्तित संस्करणों विशिष्ट अवशेषों की भूमिका का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. औषधीय एजेंटों के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया जा सकता है क्योंकि यह तकनीक अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक दोनों है। फिर भी, रेडियोधर्मिता हैंडलिंग विशेष सावधानी की आवश्यकता है. Kinase गतिविधि भी संशोधित एमिनो एसिड के फॉस्फो समूह को लक्षित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है. इस प्रकार के एंटीबॉडी सभी फॉस्फो संशोधित अवशेषों के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।
Introduction
कई दशकों के लिए, कई संकेतन रास्ते स्पष्ट किया गया है और इस तरह के सेल विभाजन, भेदभाव, गतिशीलता, क्रमादेशित सेल मौत, प्रतिरक्षा और neurobiology के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी, दिखाया गया है। किनेस इन संकेतन पथों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि वे प्राय : अपने सक्रियण या निष्क्रियता को सूक्ष्म रूप से नियंत्रित करते हैं और क्षणिक बहुमुखी परिसरों का हिस्सा होते हैं जो बाह्य उद्दीपकों1,2,3का जवाब देते हैं . किनेस के उत्परिवर्तन और अपघटन अक्सर मनुष्यों में बीमारियों का कारण बन जाते हैं, और इसलिए वे पिछले चालीस वर्षों में 4 वर्षों में सबसे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्यों में से एक बन गए हैं .
इस संदर्भ में, यह महत्वपूर्ण है कि वे अपने अपस्ट्रीम विनियामकों या डाउनस्ट्रीम सबस्ट्राट्स के साथ काइनाज संपर्क का पता लगा सकें और नए भागीदारों की पहचान कर सकें। एफ़िनिटी शुद्धि और इम्यूनोप्रीफिकेशन प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए बहुत शक्तिशाली तकनीकहै 5. चारा प्रोटीन या kinase एक विशिष्ट पेप्टाइड अनुक्रम के साथ टैग किया जा सकता है वाणिज्यिक मोती covalently पेप्टाइड को लक्षित एंटीबॉडी के साथ युग्मित का उपयोग की अनुमति. यह सामग्री6,7,8के प्रयोगों में उच्च पुनरूत्थानीयता की अनुमति देती है . अंतर्जात प्रोटीन भी सीधे चारा प्रोटीन को लक्षित एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रतिरक्षा preprecipitated किया जा सकता है. एंटीबॉडी को प्रोटीन ए या प्रोटीन जी अगारोस मोतियों से क्रॉस-लिंक किया जा सकता है या lysate जोड़ने से पहले इन मोतियों के साथ बस इनक्यूबे को इनक्यूबेट किया जा सकता है। Lysis बफ़र्स बातचीत खोने के बिना प्रोटीन solubilization अनुमति देने के लिए और प्रोटीन गिरावट से बचने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख दोष यह है कि सेल lysis पर बातचीत का पता चला है; इसलिए, क्षणिक या कमजोर बातचीत, उपकोशिकीय संदर्भ की आवश्यकता होती है उन लोगों के साथ याद किया जा सकता है. अन्य तकनीकों के लिए इस तरह के निकटता लिगेशन परख (पीएलए)9के रूप में सेल में सीधे काम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, vivo पार से जोड़ने की मदद से आत्मीयता शुद्धि (XAP)10, Bioluminscence अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (BRET) या F$rster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (FRET)11,12. इसके अलावा, प्रतिरक्षा बाइंडिंग के ऊष्मागतिक स्थिरांकों को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नहीं है, जिसके लिए भौतिक तकनीकजैसे सतह प्लासमोन अनुनाद, आइसोथर्मन कैलोरीमिति या माइक्रोस्केल थर्मोफोरोसिस की आवश्यकता होती है। 13,14.
Kinase गतिविधि कई तकनीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. इसमें, हमने फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी और इन विट्रो पर ध्यान केंद्रित किया [32पी] एटीपी (एडिनोसाइन ट्राइफॉस्फेट) लेबलिंग। फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटीन के भीतर एक विशेष अवशेषों के फॉस्फेट संशोधन को लक्षित करते हैं। वे सेल lysis के बाद पश्चिमी ब्लॉट या ELISA (एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख) में इस्तेमाल किया जा सकता है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, और भी बरकरार कोशिकाओं पर प्रवाह साइटोमेट्री या इम्यूनोफ्लूरसेंस का उपयोग कर. उनकी कमियों में विशिष्टता की कमी शामिल हो सकती है, जिसे लक्ष्य प्रोटीन के उत्परिवर्तित संस्करण का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है, और उनके सभी प्रोटीन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं किया जा रहा है। इन विट्रो में[ 32P] एटीपी लेबलिंग एक बहुत मजबूत, अच्छी तरह से स्थापित और अत्यधिक संवेदनशील विधि15है। इम्यूनोप्रिसिपेटयाट या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है, और विभिन्न substrates परीक्षण किया जा सकता है. दवाओं के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया जा सकता है क्योंकि यह विधि मात्रात्मक है। इसकी प्रमुख खामी यह है कि दृष्टिकोण से जुड़ी रेडियोधर्मिता को सावधानी से निपटने की आवश्यकता है। वैकल्पिक तरीकों भी फ्लोरोसेंट या luminescent पेप्टाइड substrates की माप के आधार पर संभव हो रहे हैं और फॉस्फोरिलेशन पर बदल फ्लोरोसेंट / इस तरह के तरीकों को भी उच्च थ्रूपुट की अनुमति है, जो आवश्यक है, उदाहरण के लिए, अणुओं की स्क्रीनिंग में जो लक्ष्य kinase के संभावित inhibitors हो सकता है. वास्तव में, kinases दवा कंपनियों द्वारा अपनाई गई दवा लक्ष्यों के सबसे बड़े वर्गों में से एक का प्रतिनिधित्व करतेहैं 16.
इस अध्ययन में, हम LIMK2-1 प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 Kinase आइसोफॉर्म 2-1) के लिए खड़ा है. LIMK2 kinase प्रोटीन पहली बार 199517में वर्णित किया गया था . LIMK2 के तीन समरूप वैकल्पिक splicing द्वारा उत्पादित कर रहे हैं: LIMK2a, LIMK2b और LIMK2-1. वर्तमान में, LIMK2-1 केवल एक ही अध्ययन18में MRNA स्तर पर वर्णित किया गया है. यहाँ, हम मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर इस संभावित नए kinase प्रोटीन की विशेषता है. सबसे पहले, हम प्रदर्शित करता है कि LIMK2-1 वास्तव में संश्लेषित है. अपने दो समकक्षों के समान, LIMK2a और LIMK2b, यह अपस्ट्रीम kinase रॉक (रो संबद्ध प्रोटीन kinase) के साथ सूचना का आदान-इन करता है। हम दिखाते हैं LIMK2-1 Myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) पर एक kinase गतिविधि है, लेकिन cofilin पर नहीं, LIM kinases के विहित सब्सट्रेट.
Protocol
Representative Results
Discussion
इसमें, हमने आणविक स्तर पर एक नया प्रोटीन, LIMK2-1 की विशेषता के लिए मजबूत जैव रासायनिक उपकरणों का उपयोग किया है, जो इसके अनुक्रम के आधार पर और इसके समलॉग, LIMK2a और LIMK2b20पर एक काइनेज माना जाता है।
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ला लिग contre ले कैंसर, l’Association Neurofibromatoses एट Recklinghausen, और ला R$gion केंद्र Val de Loire द्वारा समर्थित किया गया था. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के लिए Aurlie Cosson और डीबोरा Casas के लिए बहुत धन्यवाद, और पांडुलिपि की पूरी तरह से proofreading के लिए Keyron Hickman-Lewis के लिए.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
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