In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen
Summary
Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.
Abstract
Pluripotente stamcellen bieden een groot potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en ziekte en voor regeneratieve geneeskunde. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot het genereren van hartcellen uit pluripotente stamcellen, is het onduidelijk of de twee cardiale velden-de eerste en tweede hart velden (FHF en SHF)-worden geïnduceerd in pluripotente stamcellen systemen. Om dit aan te pakken, genereerden we een protocol voor in vitro specificatie en isolatie van hartveld-specifieke cardiale stamcellen. We gebruikten embryonale stamcellen lijnen die Hcn4-GFP en Tbx1-CRE; Rosa-offerte reporters van de FHF en de SHF, respectievelijk, en levende cel immunokleuring van de celmembraan eiwit Cxcr4, een SHF marker. Met deze aanpak genereerden we voorlopercellen die de functionele eigenschappen en transcriptoom van hun in vivo recapituleren. Ons protocol kan worden gebruikt om vroege specificatie en scheiding van de twee hart gebieden te bestuderen en kamer-specifieke hartcellen voor de modellering van de hartkwaal te produceren. Aangezien dit een in vitro organite systeem is, kan het geen nauwkeurige anatomische informatie verstrekken. Echter, dit systeem overwint de slechte bereikbaarheid van gastrulation embryo’s en kan worden opgeschaald voor high-throughput schermen.
Introduction
Het gebruik van pluripotente stamcellen (psc’s) heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van cardiale regeneratie en gepersonaliseerde geneeskunde met patiënt-specifieke myocytes voor ziektemodel lering en drugs therapieën1,2,3, 4. meer recentelijk, in vitro protocollen voor de generatie van atriale VS ventriculaire evenals pacemaker-achtige PSC-afgeleide cardiomyocytes zijn ontwikkeld5,6. Echter, of cardiogenesis kan worden herschapen in vitro om cardiale ontwikkeling te bestuderen en vervolgens te genereren ventriculaire kamer-specifieke cardiale cellen is nog steeds onduidelijk.
Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, mesodermaal cellen onder invloed van afgescheiden morphogens zoals BMP4, Wnts en Activin een vorm van de primitieve streak7. Cardiale mesodermaal cellen gekenmerkt door de expressie van Mesp1, migreren naar voren en de laatste tijd om de hart sikkel en vervolgens de primitieve hart buis7,8te vormen. Deze migrerende groep van cellen omvat twee zeer verschillende populaties van cardiale stamcellen (cpc’s), namelijk de eerste en de tweede hartveld (fhf en SHF)9,10. Cellen uit de SHF zijn zeer proliferative en trekkende en zijn primair verantwoordelijk voor de rek-en lus van de hart buis. Bovendien, SHF cellen differentiëren tot cardiomyocytes, fibroblasten, gladde spieren en endothelial cellen als ze in het hart buis om de rechter ventrikel, rechter ventrikel uitstroom tractus en een groot deel van beide atria7,10te vormen. In tegenstelling, FHF cellen zijn minder proliferatie en trekkende en differentiëren vooral om cardiomyocytes als ze aanleiding geven tot de linker ventrikel en een kleiner deel van de atria11. Bovendien SHF progenitoren worden gekenmerkt door de expressie van Tbx1, FGF8, FGF10 en Six2, terwijl fhf cellen Express Hcn4 en Tbx511, 12,13,14,15.
Psc’s kan aan alle drie kiem lagen en later aan om het even welk type van cel in lichaam4,16onderscheiden. Daarom bieden ze een enorm potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en voor het modelleren van specifieke ontwikkelingsstoornissen resulteert in aangeboren hart-en vaatziekten, de meest voorkomende oorzaak van aangeboren afwijkingen17. Een grote subgroep van aangeboren hartziekte omvat kamer-specifieke cardiale afwijkingen18,19. Nochtans, is het nog onduidelijk of deze uit abnormale hart gebiedsontwikkeling voortkomen. Bovendien, gezien het onvermogen van cardiomyocytes te vermenigvuldigen na de geboorte, zijn er uitgebreide inspanningen om cardiale weefsel te creëren voor hart regeneratie1,7,20. Gezien de fysiologische en morfologische verschillen tussen hartkamers, is het genereren van kamer-specifieke cardiale weefsels met behulp van Psc’s van groot belang. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot een robuuste generatie van cardiale cellen van Psc’s, is het nog onduidelijk of de twee hart velden kunnen worden geïnduceerd in PSC-systemen.
Om recapituleren cardiogenesis in vitro en de studie van de specificatie en de eigenschappen van cpc’s, hebben we eerder gebruik gemaakt van een systeem op basis van differentiëren PSC-afgeleide cardiale sferoïden21,22,23,24. Onlangs hebben we gegenereerd muis embryonale stamcellen (mESCs) met GFP en offerte verslaggevers onder de controle van de FHF gen Hcn4 en de SHF gen Tbx1, respectievelijk (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP) 25. In vitro gedifferentieerde mESCs gevormd cardiale sferoïden waarin GFP + en offerte + cellen verschenen uit twee verschillende gebieden van mesodermaal cellen en patroon in een complementaire wijze. De resulterende GFP + en offerte + cellen tentoongesteld FHF en SHF kenmerken, respectievelijk, bepaald door RNA-sequencing en klonale analyses. Belangrijk is, met behulp van mESCs die de Isl1-offerte Reporter (mESCIsl1-offerte), ontdekten we dat SHF cellen getrouw werden gekenmerkt door de cel-oppervlakte-eiwit CXCR4, en dit kan de isolatie van hartgebied-specifieke cellen mogelijk te maken zonder transgenen. Het huidige protocol beschrijft de generatie en isolatie van hart-specifieke Cpc’s van mESCs, die als waardevol instrument kunnen dienen voor het bestuderen van kamer-specifieke hartziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In ons protocol beschrijven we een methodologie om cardiale sferoïden en geïsoleerde hartveld-specifieke Cpc’s te genereren. Die kunnen worden gebruikt om mechanismen van CPC-specificatie en hun eigenschappen te bestuderen, evenals voor cardiale kamer-specifieke ziektemodel lering. Één eerder gepubliceerd werk gebruikte een mESC lijn met twee fluorescente verslaggevers (Mef2c/Nkx 2.5) om cardiogenesis in vitro te bestuderen, echter, worden beide markeringen uitgedrukt bij embryonale dag 9.5-10 wanneer cardiomyocytes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. werd ondersteund door de magie die telt en AHA. C. K. werd gesteund door toelagen van NICHd/NIH (R01HD086026), AHA, en MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. 발생학. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. 발생학. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
