In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro
Summary
Le but de cette méthode est de générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque in vitro afin d’étudier la spécification des cellules progénitrices et les propriétés fonctionnelles, et de générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes offrent un grand potentiel pour comprendre le développement cardiaque et la maladie et pour la médecine régénérative. Bien que les progrès récents de la cardiologie développementale aient conduit à la production de cellules cardiaques à partir de cellules souches pluripotentes, on ne sait pas si les deux champs cardiaques – les premier et deuxième champs cardiaques (FHF et SHF) – sont induits dans les systèmes de cellules souches pluripotentes. Pour remédier à cette situation, nous avons généré un protocole de spécification in vitro et d’isolement des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque. Nous avons utilisé des lignées de cellules souches embryonnaires transportant Hcn4-GFP et Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters de la FHF et le SHF, respectivement, et immunostaining cellulaire séminueux vivant de la protéine de membrane cellulaire Cxcr4, un marqueur SHF. Avec cette approche, nous avons généré des cellules progénitrices qui récapitulent les propriétés fonctionnelles et le transcriptome de leurs homologues in vivo. Notre protocole peut être utilisé pour étudier la spécification précoce et la ségrégation des deux champs cardiaques et pour générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques. Puisqu’il s’agit d’un système organoïde in vitro, il peut ne pas fournir d’informations anatomiques précises. Cependant, ce système surmonte la faible accessibilité des embryons au stade de la gaztrulation et peut être mis à niveau pour les écrans à haut débit.
Introduction
L’utilisation de cellules souches pluripotentes (CSP) a révolutionné le domaine de la régénération cardiaque et de la médecine personnalisée avec des myocytes spécifiques aux patients pour la modélisation des maladies et les pharmacothérapies1,2,3, 4. Plus récemment, des protocoles in vitro pour la génération de cardiomyocytes auriculaires vs ventriculaires ainsi que des stimulateurs cardiaques dérivés de PSC ont été développés5,6. Cependant, si la cardiogenèse peut être recréée in vitro pour étudier le développement cardiaque et par la suite produire des cellules cardiaques ventriculaires spécifiques à la chambre est encore peu claire.
Au début du développement embryonnaire, les cellules mésodermales sous l’influence de morphogènes sécrétés tels que BMP4, Wnts et Activin A forment la strie primitive7. Les cellules mésodermales cardiaques marquées par l’expression de Mesp1, migrent antérieurement et dernièrement pour former le croissant cardiaque, puis le tube cardiaque primitif7,8. Ce groupe migratoire de cellules comprend deux populations très distinctes de cellules progénitrices cardiaques (CPC), à savoir le premier et le deuxième champ cardiaque (FHF et SHF)9,10. Les cellules de la SHF sont hautement proliférantes et migratrices et sont principalement responsables de l’allongement et de la boucle du tube cardiaque. En outre, les cellules SHF se différencient en cardiomyocytes, fibroblastes, muscles lisses et cellules endothéliales comme ils entrent dans le tube cardiaque pour former le ventricule droit, le tractus ventriculaire droit et une grande partie des deuxoreillettes 7,10. En revanche, les cellules FHF sont moins proliférantes et migratrices et se différencient principalement aux cardiomyocytes car elles donnent lieu au ventricule gauche et à une plus petite partie des oreillettes11. En outre, les progéniteurs SHF sont marqués par l’expression de Tbx1, FGF8, FGF10 et Six2 tandis que les cellules FHF expriment Hcn4 et Tbx511,12,13,14,15.
Les CSP peuvent se différencier des trois couches germinales et, par la suite, de n’importe quel type de cellule dans le corps4,16. Par conséquent, ils offrent un potentiel énorme pour comprendre le développement cardiaque et pour modéliser des défauts développementaux spécifiques ayant pour résultat la maladie cardiaque congénitale, la cause la plus fréquente des défauts de naissance17. Un grand sous-groupe de maladie cardiaque congénitale inclut des anomalies cardiaques de chambre-spécifiques18,19. Cependant, il ne sait toujours pas si ceux-ci proviennent du développement anormal du champ cardiaque. En outre, étant donné l’incapacité des cardiomyocytes à proliférer après la naissance, il ya eu des efforts considérables pour créer des tissus cardiaques pour la régénération cardiaque1,7,20. Compte tenu des différences physiologiques et morphologiques entre les chambres cardiaques, la génération de tissu cardiaque spécifique à la chambre à l’aide de CSP est d’une importance significative. Bien que les progrès récents en cardiologie développementale aient mené à la génération robuste de cellules cardiaques des PSC, il est toujours peu clair si les deux champs de coeur peuvent être induits dans des systèmes de PSC.
Pour récapituler la cardiogenèse in vitro et étudier les spécifications et les propriétés des CPC, nous avons déjà utilisé un système basé sur la différenciation des sphéroïdes cardiaques dérivés de la CFP21,22,23,24. Récemment, nous avons produit des cellules souches embryonnaires de souris (MESC) avec des reporters de GFP et de DP sous le contrôle du gène Hcn4 de FHF et du gène Tbx1 de SHF, respectivement (mESCtbtb1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Les MESC différenciés in vitro ont formé des sphéroïdes cardiaques dans lesquels les cellules GFPet et RFPsont apparues de deux zones distinctes de cellules mésodermales et modelées d’une manière complémentaire. Les cellules GFPMD et RFPMD qui en ont résulté présentaient respectivement des caractéristiques FHF et SHF, déterminées par des analyses de séquençage de l’ARN et de clonal. Fait important, en utilisant des MESC transportant le journaliste Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), nous avons découvert que les cellules SHF étaient fidèlement marquées par la protéine de surface cellulaire CXCR4, ce qui peut permettre l’isolement des cellules spécifiques au champ cardiaque sans transgènes. Le protocole actuel décrira la génération et l’isolement des CPC spécifiques au champ cardiaque à partir des CSE, qui peuvent servir d’outil précieux pour l’étude des maladies cardiaques propres à la chambre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans notre protocole, nous décrivons une méthodologie pour produire des sphéroïdes cardiaques et des CPC isolés spécifiques au champ cardiaque. Ceux-ci peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de spécification scPC et leurs propriétés, ainsi que pour la modélisation des maladies spécifiques à la chambre cardiaque. Un travail précédemment édité a employé une ligne de MESC avec deux journalistes fluorescents (Mef2c/Nkx2.5) pour étudier la cardiogenèse in vitro, cependant, ces deux marqueurs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. a été soutenu par The Magic That Matters et AHA. C. K. a reçu l’appui de subventions du NICHD/NIH (R01HD086026), de l’AHA et du MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
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