In vitro generasjon av mus hjerte Field-spesifikke CARDIAC stamceller

Summary

Formålet med denne metoden er å generere hjerte Feltspesifikke CARDIAC stamceller in vitro for å studere Stamcelle spesifikasjonen og funksjonelle egenskaper, og å generere kammer spesifikke CARDIAC celler for hjertesykdom modellering.

Abstract

Pluripotent stamceller tilbyr stort potensial for å forstå hjerte utvikling og sykdom og for regenererende medisin. Mens de siste fremskritt i utviklingsmessige kardiologi har ført til generering av CARDIAC celler fra Pluripotent stamceller, er det uklart om de to CARDIAC felt-den første og andre hjerte felt (FHF og SHF)-er indusert i Pluripotent stamceller systemer. For å løse dette, genererte vi en protokoll for in vitro spesifikasjon og isolering av hjerte felt-spesifikke CARDIAC stamceller. Vi brukte embryonale stamceller linjer bærer Hcn4-GFP og Tbx1-grobunn; Rosa-RFP journalister av FHF og SHF, henholdsvis, og live celle immunostaining av cellemembranen protein Cxcr4, en SHF markør. Med denne tilnærmingen genererte vi stamceller som recapitulate de funksjonelle egenskapene og transcriptome til deres in vivo motstykker. Vår protokoll kan utnyttes til å studere tidlig spesifikasjon og segregering av de to hjerte felt og å generere kammer-spesifikke CARDIAC celler for hjertesykdom modellering. Siden dette er et in vitro organoid system, kan det ikke gi presis anatomisk informasjon. Men, dette systemet overvinner dårlig tilgjengelighet av gastrulation-scenen embryo og kan oppskalert for høy gjennomstrømming skjermer.

Introduction

Bruken av Pluripotent stamceller (PSCer) har revolusjonert feltet av CARDIAC regenerering og personlig medisin med pasient-spesifikke myocytter for sykdoms modellering og narkotikabehandling^{1,2,3, 4}. mer nylig har in vitro protokoller for generering av atrieflimmer vs ventrikkel samt pacemaker-lignende cardiomyocytes har blitt utviklet^5,6. Men om cardiogenesis kan gjenopprettes in vitro for å studere hjerte utvikling og deretter generere ventrikkel kammer spesifikke CARDIAC celler er fortsatt uklart.

Under tidlig embryoutvikling, mesodermal celler under påvirkning av utskilt morphogens som BMP4, Wnts og Activin A danner primitive strek⁷. CARDIAC mesodermal celler preget av uttrykk for Mesp1, migrere anteriort og senere tid å danne CARDIAC halvmåne og deretter primitive hjerte tube^7,8. Denne trekk gruppen av celler inneholder to svært distinkte populasjoner av hjerte stamceller (CPC), nemlig det første og det andre hjerte feltet (FHF og SHF)^9,10. Celler fra SHF er svært proliferativ og trekk, og er primært ansvarlig for forlengelse og looping av hjertet røret. I tillegg SHF celler differensiere til cardiomyocytes, fibroblaster, glatt muskel og endothelial celler som de kommer inn i hjertet røret for å danne høyre ventrikkel, høyre ventrikkel utløp og stor del av både Atria^7,10. I kontrast, FHF celler er mindre proliferativ og trekk og skille hovedsakelig til cardiomyocytes som de gir opphav til venstre ventrikkel og en mindre del av Atria¹¹. I tillegger SHF forfedre preget av uttrykk for Tbx1, FGF8, FGF10 og Six2 mens FHF celler uttrykker Hcn4 og Tbx5^11,12,13,^14,15.

PSCer kan differensiere til alle tre bakterie lag og deretter til en hvilken som helst celle type i kroppen^4,16. Derfor tilbyr de enormt potensial for å forstå hjerte utvikling og for modellering spesifikke utviklingsmessige defekter som resulterer i medfødt hjertesykdom, den hyppigste årsaken til fødselen defekter¹⁷. En stor undergruppe av medfødt hjertesykdom inkluderer kammer-spesifikke CARDIAC unormalt^18,19. Men det fortsatt uklart om disse stammer fra uregelrett hjerte feltutbygging. I tillegg, gitt manglende evne til cardiomyocytes å spre etter fødselen, har det vært omfattende anstrengelser for å skape hjerte vev for hjertet gjenfødelse^1,7,20. Tatt i betraktning de fysiologiske og morfologiske forskjellene mellom CARDIAC kamre, generasjon av kammer-spesifikke CARDIAC vev bruker PSCer er av vesentlig betydning. Mens nylige fremskritt innen utviklings kardiologi har ført til en robust generasjon av CARDIAC celler fra PSCer, er det fortsatt uklart om de to hjerte feltene kan bli indusert i PSC-systemer.

For å recapitulate cardiogenesis in vitro og studere spesifikasjonen og egenskapene til CPC, har vi tidligere brukt et system basert på differensiering av PSC-avledet CARDIAC spheroids²¹,²²,^23,24. Nylig genererte vi mus embryonale stamceller (mESCs) med GFP og RFP journalister under kontroll av FHF genet Hcn4 og SHF genet Tbx1, henholdsvis (mESCs^{Tbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP}) ²⁵. In vitro differensiert mESCs dannet CARDIAC spheroids der GFP + og RFP + celler dukket opp fra to forskjellige områder av mesodermal celler og mønstret på en komplementær måte. De resulterende GFP +-og RFP +-cellene viste henholdsvis FHF-og SHF-egenskapene, bestemt av RNA-sekvensering og klonal-analyser. Betydelig, benytter mESCs bærer det Isl1-RFP reporter (mESC^Isl1-RFP), vi oppdaget det SHF celler var trofast Fair av cellen-overflate protein CXCR4, og denne kanne sette i stand isolasjon av hjertet åker-spesifikk celler uten transgenes. Den nåværende protokollen vil beskrive generering og isolering av hjerte Feltspesifikke CPC-er fra mESCs, som kan tjene som et verdifullt verktøy for å studere kammer spesifikk hjertesykdom.

Protocol

Merk: In vitro generasjon av hjerte felt-spesifikk mus CARDIAC stamceller (figur 1). 1. vedlikehold av mus ESCs Grow mESCs (mESCsTbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP, MESCISL1-RFP)25 på 0,1% (w/v) gelatin belagt T25 flasker i 2i medium (870 ml GLASCOW minimum viktig medium (GMEM), 100 ml fosterets storfe serum (FBS), 10 mL av GlutaMAX, 10 ml av ikke-essensielle aminosyrer, 10 m…

Representative Results

Etter ca 132 h av differensiering, kan Tbx1-RFP og Hcn4-GFP CPC oppdages ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (figur 2). Vanligvis, GFP og RFP celler komme ca i nærheten det likt tid. De to populasjoner av CPC fortsetter å ekspandere i umiddelbar nærhet og ofte i et utfyllende mønster. Justering av konsentrasjonen av Activin A og BMP4 vil endre prosentene av FHF vs SHF CPC (Figur 3). CPC-spesifikasjonen in vitro ble først og fremst bestemt av konsentras…

Discussion

I vår protokoll beskriver vi en metodikk for å generere hjerte-spheroids og isolerte hjerte Feltspesifikke CPC-er. De kan brukes til å studere mekanismer for CPC-spesifikasjonen og deres egenskaper, så vel som for CARDIAC kammer-spesifikk sykdom modellering. En tidligere publisert arbeid brukt en mESC linje med to fluorescerende journalister (Mef2c/Nkx 2.5) for å studere cardiogenesis in vitro, men begge disse markørene uttrykkes på embryonale dag 9.5-10 når cardiomyocytes er allerede dannet^26</…

Materials

β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
0.1% (w/v) Gelatin	EMD Millipore	ES-006-B
100mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360
100X Pen/Strep	Gibco	15070-063
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Thermo Fisher Scientific	21-040-CV
20% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	50-980-493
5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer	BD Falcon	35223
Activin A	R & D Systems	338-AC-010
Ascorbic Acid	Sigma	A-4544
B27 minus vitamin A (50x)	Thermo Fisher Scientific	12587010
BMP4	R & D Systems	314-BP
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Cell sorter	Sony	SH800	Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μm	Thermo Fisher Scientific	08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XT	Thermo Fisher Scientific	75004508
CHIR99021	Selleck chemicals	S2924
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flask	Corning	07-200-875
Countless II FL automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)	Gibco	11965-092
EDTA	Sigma	E6758
ESGRO (LIF)	Millipore	ESG1106
EVOS FL microscope	Thermo Fisher Scientific	AMF4300
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	SH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)	Gibco	11710035
GlutaMAX (100 x)	Gibco	35050-061
Ham’s F12	Gibco	10-080-CV
HEPES	Sigma	H3375
IMDM	Gibco	12440053
Monothioglycero (MTG)	Sigma	M-6145
Mouse anti-Troponin T antibody	Thermo Fisher Scientific	MS-295-P1
N2-SUPPLEMENT	Gibco	17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAA	Invitrogen	11140-050
PD0325901	Selleckchem	S1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody	Thermo Fisher Scientific	46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25mm	Corning	430597
T25 flasks	Corning	353109
TrypLE (Trypsin)	Gibco	12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Stem cell technologies	72304