In vitro geração de células progenitoras cardíacas específicas do coração do rato
Summary
O objetivo deste método é gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco in vitro para estudar a especificação de células progenitoras e propriedades funcionais, e para gerar células cardíacas específicas de câmara para modelagem de doenças cardíacas.
Abstract
Células-tronco pluripotentes oferecem grande potencial para a compreensão do desenvolvimento do coração e da doença e para a medicina regenerativa. Embora os recentes avanços na Cardiologia do desenvolvimento tenham levado a gerar células cardíacas a partir de células-tronco pluripotentes, não é claro se os dois campos cardíacos-o primeiro e o segundo campos cardíacos (FHF e SHF) – são induzidos em sistemas de células-tronco pluripotentes. Para abordar este, nós geramos um protocolo para in vitro a especificação e a isolação de pilhas cardíacas campo-específicas do progenitor do coração. Foram utilizadas linhagens de células-tronco embrionárias portadoras de Hcn4-GFP e Tbx1-CRE; Os repórteres de rosa-RFP do FHF e do SHF, respectivamente, e a imunomarcação da pilha viva da proteína Cxcr4 da membrana de pilha, um marcador de SHF. Com esta aproximação, nós geramos as pilhas do progenitor que recapitular as propriedades funcionais e o transcriptoma de seus homólogos in vivo. Nosso protocolo pode ser utilizado para estudar a especificação adiantada e a segregação dos dois campos do coração e para gerar pilhas cardíacas câmara-específicas para a modelagem da doença cardíaca. Uma vez que este é um sistema organoide in vitro, não pode fornecer informações anatômicas precisas. No entanto, este sistema supera a má acessibilidade dos embriões de estágio de gastrulação e pode ser aumentado para telas de alta taxa de transferência.
Introduction
O uso de células-tronco pluripotentes (PSCs) revolucionou o campo de regeneração cardíaca e medicina personalizada com miócitos específicos do paciente para modelagem de doenças e terapias medicamentosas1,2,3, 4. mais recentemente, os protocolos in vitro para a geração de cardiomiócitos atrial vs ventricular, bem como de marca-passo-tipo PSC-derivados têm sido desenvolvidos5,6. No entanto, se a cardiogênese pode ser recriada in vitro para estudar o desenvolvimento cardíaco e, posteriormente, gerar células cardíacas específicas da câmara ventricular ainda não está clara.
Durante o desenvolvimento embrionário adiantado, as pilhas Mesodermal a influência de espécies secretado tais como BMP4, wnts e activin a formam a raia primitiva7. Células mesodérmicas cardíacas marcadas pela expressão de Mesp1, migram anterioramente e ultimamente para formar o crescente cardíaco e, em seguida, o tubo do coração primitivo7,8. Este grupo migratório de células inclui duas populações muito distintas de células progenitoras cardíacas (CPCS), ou seja, o primeiro e o segundo campo cardíaco (FHF e SHF)9,10. As células do SHF são altamente proliferativas e migratórias e são principalmente responsáveis pelo alongamento e looping do tubo cardíaco. Adicionalmente, as células de SHF diferenciam-se aos cardiomiócitos, fibroblastos, músculo liso e células endoteliais à medida que entram no tubo cardíaco para formar o ventrículo direito, o trato de saída do ventrículo direito e grande parte de ambos os átrios7,10. Em contrapartida, as células FHF são menos proliferativas e migratórias e diferenciam-se principalmente dos cardiomiócitos, pois dão origem ao ventrículo esquerdo e menor parte dos átrios11. Além disso, os progenitores de SHF são marcados pelaexpressão de Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 enquanto as células FHF expressam Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.
PSCs pode diferenciar-se a todas as três camadas do germe e subseqüentemente a todo o tipo da pilha no corpo4,16. Conseqüentemente, oferecem o potencial tremendo para compreender o desenvolvimento do coração e para modelar defeitos desenvolventes específicos tendo por resultado a doença cardíaca congenital, a causa a mais freqüente de defeitos de nascimento17. Um grande subgrupo de cardiopatia congênita inclui anormalidades cardíacas específicas da câmara,18,19. Entretanto, ainda incerto se estes originam do desenvolvimento anômalo do campo do coração. Além disso, dada a incapacidade de os cardiomiócitos proliferar após o nascimento, tem havido esforços extensivos para criar tecido cardíaco para a regeneração cardíaca1,7,20. Considerando as diferenças fisiológicas e morfológicas entre as câmaras cardíacas, a geração de tecido cardíaco específico da câmara utilizando PSCs é de importância significativa. Quando os avanços recentes na Cardiologia desenvolvente conduziram à geração robusta de pilhas cardíacas de PSCs, é ainda obscuro se os dois campos do coração podem ser induzidos em sistemas do PSC.
Para recapitular a cardiogênese in vitro e estudar a especificação e as propriedades de CPCS, utilizou-se previamente um sistema baseado na diferenciação de esferóides cardíacos derivados do PSC21,22,23,24. Recentemente, geramos células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) com repórteres GFP e RFP o controle do gene FHF Hcn4 e do gene SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Os mESCs diferenciados in vitro formaram esferóides cardíacos nos quais as células GFP + e RFP + apareceram de duas áreas distintas de células mesodérmicas e padronizadas de forma complementar. As células GFP + e RFP + resultantes exibiram características de FHF e SHF, respectivamente, determinadas por sequenciamento de RNA e análises clonais. Importante, usando mESCs carregando o Isl1-RFP Reporter (mESCIsl1-RFP), descobrimos que as células de SHF foram fielmente marcadas pela proteína de superfície celular CXCR4, e isso pode permitir o isolamento de células específicas do campo cardíaco sem transgenes. O protocolo atual descreverá a geração e o isolamento de CPCs de campo específico do coração de mESCs, que pode servir como uma ferramenta valiosa para estudar a doença cardíaca câmara-específica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em nosso protocolo, nós descrevemos uma metodologia para gerar esferoides cardíacos e CPCS campo-específicos isolados do coração. Esses podem ser usados para estudar mecanismos de especificação de CPC e suas propriedades, bem como para a modelagem da doença de câmara cardíaca específica. Um trabalho publicado anteriormente utilizou uma linha de mESC com dois repórteres fluorescentes (Mef2c/nkx 2.5) para estudar a cardiogênese in vitro, no entanto, ambos os marcadores são expressos no dia embrionário 9.5-10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. foi apoiado por a magia que importa e AHA. C. K. foi apoiado por subvenções da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
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