여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.
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방법 논문
비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
단백질 핵산 상호 작용은 전사, 재조합 및 RNA 대사와 같은 생물학적 과정에 중요한 역할을 합니다. 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 실험 방법은 특정 표적 분자를 검출하고 분석하기 위해 형광 태그, 방사성 동위원소 또는 기타 라벨을 사용해야 합니다. 비방사성 핵산 라벨인 비오틴은 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)에 일반적으로 사용되지만 핵산 과정 중 단백질 활성을 모니터링하기 위해 정기적으로 사용되지는 않았습니다. 이 프로토콜은 시험관 내 효소 반응 동안 비오틴 라벨링의 유용성을 보여 주며, 이 라벨이 다양한 생화학 적 분석과 잘 작동한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 방사성 동위원소 32P표지 기판을 이용한 이전 연구 결과와 일치하여, BIOTin 표지된 EMSA를 통해 MEIOB(특히 메오틱 재조합에 관여하는 단백질)가 DNA 결합 단백질인 MOV10( RNA 헬리콥터)는 비오틴 표지RNA 이중 구조를 해결하고, MEIOB는 바이오틴 표지된 단일 가닥 DNA를 절단한다. 이 연구는 비오틴이 시험관 내에서 다양한 핵산 관련 생화학 적 세포학적 인 세포학적 인 세포학적 인 분석을 32 P로 대체 할 수 있음을 보여줍니다.
서론
단백질 핵산 상호 작용은 DNA 복구, 복제, 전사, RNA 처리 및 번역과 같은 많은 필수 세포 프로세스에서 관련시다. 염색질 내의 특정 DNA 서열과의 단백질 상호 작용은 전사 수준 1에서유전자 발현의 엄격한 제어를 위해 요구된다. 수많은 코딩 및 비코딩 RNA의 정확한 사후 상사 조절은 어떤 단백질과 RNA2사이 광범위하고 복잡한 상호 작용을 필요로 합니다. 유전자 발현 조절 메커니즘의 이 층은 그들의 핵산 표적을 가진 전사/후성 유전학 요인 또는 RNA 결합 단백질의 상호 작용에 의해 조정되는 동적 분자 간 사건의 폭포를 포함합니다, 뿐만 아니라 단백질-단백질 상호 작용. 생체 내 단백질이 핵산과 직간접적으로 연관되어 있는지, 그러한 연관성이 어떻게 발생하고 절정에 이르는지 에 대해 해부하기 위해, 시험관내 생화학적 세포학적 인 화학 적 분석을 실시하여 관심 있는 단백질의 결합 친화도 또는 효소 활성을 조사하기 위해 수행됩니다. DNA 및/또는 RNA의 설계 기판.
전기영동성이동분석법(EMSA)을 포함한 핵산-단백질 복합체를 검출하고 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었으며, 겔 지연 분석 또는밴드 시프트 분....
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프로토콜
1. 단백질 준비
- MEIOB 및 MOV10 식 구문
- cDNA 발현 구문 생성 마우스 MEIOB-A, C 및 E(도1A)및 MOV10을 인코딩한다.
- 각 단편에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응을 설정합니다. 마우스 cDNA 1 μL(C57BL/6 마우스 고환), dNTP 1 μL, 10 μM 포워드 프라이머 2 μL, 10 μM 리버스 프라이머 2 μL, DNA 폴리머라제 1μL, 2x PCR 완충제 25μL, 이중 증류H2O(ddH 2O) 18μL 50 μL의 볼륨.
참고: 메이옵 및 Mov10 유전자 단편의 증폭을 위한 프라이머는 표 1에 열거되어 있다. - 다음 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 수행하십시오 : 5 분 동안 95 °C, 15 s의 경우 95 °C에서 35 사이클, 15 s의 경우 64 °C에서 어닐링, 20 초 동안 72 °C에서 연장 (전체 길이 MOV10 연장을위한 2 분), 최종 연장은 7 분 동안 68 °C에서 수행하십시오.
참고: 프라이머 쌍 MEIOB-E(F1) 및 MEIOB-E-뮤트(R1) 및 ME....
- 각 단편에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응을 설정합니다. 마우스 cDNA 1 μL(C57BL/6 마우스 고환), dNTP 1 μL, 10 μM 포워드 프라이머 2 μL, 10 μM 리버스 프라이머 2 μL, DNA 폴리머라제 1μL, 2x PCR 완충제 25μL, 이중 증류H2O(ddH 2O) 18μL 50 μL의 볼륨.
- cDNA 발현 구문 생성 마우스 MEIOB-A, C 및 E(도1A)및 MOV10을 인코딩한다.
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결과
본 연구에서 사용되는 MEIOB및 발현 구조의 단백질 구조는 도 1A에예시되어 있다. MEIOB의 OB 접기는 단일 가닥 핵산을 인식하고 상호 작용할 수 있는 소형 배럴형 구조입니다. OB 도메인 중 하나(aa 136-307, 구성 A)는 단일 가닥 DNA(ssDNA), 잘린 단백질(aa 136-178 잘림, 구성 C) 및 MEIOB의 점 돌연변이 형태(R235A 돌연변이, 구성 E)를 결합하여 DNA 결합 활성26을갖지 않는다. GST-MEIOB 융합 단백질은 BL21 박테리아에서 과발현되었고, 후속 분리 단계는 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 정제 단백질의 결과로 나타났다 (그림1B). 상이한 농도에서의 핵산 기질은 1-3s에 대한 비교적 짧은 노출 시간 후에 1 nM 올리고의 검출 가능한 신호와.......
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토론
단백질-핵산 상호 작용을 조사하는 것은 다양한 생물학적 과정의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에 매우 중요합니다. 예를 들어, MEIOB는 포유류25,26,27에서만이기와 불임에 필수적인 고환 특이적 단백질이다. MEIOB는 단일 가닥 DNA에 결합하고 meiotic 재결합 동안 의 생리적 관련성에 직접적으로 관련되는 3' 5' 외핵활성26을전시하는 OB 도메인을 포함합니다. 또 다른 예로서, MOV10은 RNA 이차구조(16)와연관될 수 있는 유비쿼터스 기능을 가진 RNA 헬리콥터이다. 이에 따라, MOV10은 광범위한 RNA 결합 특성 및 5' to 3' RNA 이중 해제 활성16을표시한다. 이 단백질의 위에서 언급한 생화.......
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공개 사항
이해 상충은 선언되지 않습니다.
감사의 글
우리는 도움이 편집 및 토론에 대한 P. 제레미 왕 (펜실베니아 대학)에 감사드립니다. 우리는 또한 언어 편집시그리드 에카르트에게 감사드립니다. K. Z.는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2016YFA0500902, 2018YFC1003500)과 중국 국립자연과학재단(31771653)의 지원을 받았습니다. L. Y.는 중국 국립 자연 과학 재단 (81471502, 31871503)과 장쑤성의 혁신및 기업가 프로그램에 의해 지원되었습니다. J. N. 절강 의료 과학 기술 프로젝트 (2019KY499)에 의해 지원되었다. M. L.은 중국 국립 자연과학 재단(31771588)과 1000청소년 인재 계획의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, 미국 | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, 미국 | TE77XP | |
| 튜브 리볼버 | 크리스탈, 미국 | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, 미국 | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| 나일론 막 | Thermo Scientific, 미국 | TG263940A | |
| TC 처리 배양 접시 | Corning, 미국 | 430167 | 100 mm |
| TC 처리된 배양 접시 | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| 마이크로튜브 튜브 | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| 튜브 | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, 중국 | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 마그네틱 비드 | Sigma, 미국 | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, 미국 | 591136 | |
| BCIP/NBT 알칼리성 포스파타제 색상 개발 키트 | Beyotime, 중국 | C3206 | |
| CelLyticTM M 세포 용해 시약 | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II 원 스텝 클로닝 키트 | Vazyme, 중국 | C112 | |
| 화학발광 핵산 검출 키트 | Thermo Scientific, 미국 | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, 미국 | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, 미국 | 10569044 | |
| DPBS 버퍼 | Gibco, 미국 | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, 미국 | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche, 미국 | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, 중국 | DC202 | |
| FastPure Gel DNA 추출 미니 키트 | Vazyme, 중국 | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, 미국 | 10437028 | |
| FLAG 펩타이드 | Sigma, 미국 | F4799 | |
| 글리세롤 | 시그마, 미국 | SHBK3676 | |
| GST 벌크 키트 | GE Healthcare, 미국 | 27-4570-01 | |
| HEPES 버퍼 | 시그마, 미국 | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, 미국 | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, 중국 | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 형질주입 시약 | Thermo Scientific, 미국 | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, 미국 | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, 미국 | AM9759 | 5 미터 |
| NP-40 | Amresco, 미국 | M158-500ML | |
| Opti-MEM 배지 | Gibco, 미국 | 31985062 | |
| PBS | Gibco, 미국 | 10010023 PH 7.4 | |
| RNase 억제제 | Promega, 미국 | N251B | |
| Streptavidin 알칼리성 인산가수분해효소 | Promega, 미국 | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, 미국 | 15581044 | |
| 트리스-HCI 버퍼 | Invitrogen, 미국 | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI 버퍼 | Invitrogen, 미국 | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, 중국 | A600560 |
참고문헌
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi....
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재인쇄 및 허가
