这里介绍了创建能够生长的基于肽的小型单片杆菌囊泡的协议。为了便于膜肽的囊泡生产,这些囊泡配备了转录翻译系统和肽编码质粒。
生化反应的分块化是合成细胞的核心方面。为此,肽反应室是脂体或脂肪酸基囊泡的诱人替代品。在体囊外部或内部,肽可以很容易地表达并简化膜前体的合成。此处提供了一种基于两栖弹性蛋白样多肽 (ELP) 利用玻璃珠脱水补液创建直径为 ±200 nm 的囊泡的协议。还介绍了细菌ELP表达和通过逆温循环纯化的协议,以及它们与荧光染料的共价功能化。此外,本报告还描述了一种使RNA aptamer dBroccoli在ELP囊泡内转录的协议,作为生化反应的一个不太复杂的例子。最后,提供了一个方案,允许荧光蛋白和膜肽的囊泡表达,而后者的合成导致囊泡生长。
合成活细胞系统的创建通常从两个不同的方向进行。在自上而下的方法中,细菌的基因组被简化为其基本成分,最终导致最小的细胞。在自下而上的方法中,人工细胞从分子组分或细胞子系统中组装,需要功能上集成到一致的细胞样系统中。
在de novo方法中,必要的生化成分的分门别类通常是使用磷脂或脂肪酸1、2、3、4制成的膜实现的。这是因为”现代”细胞膜主要由磷脂组成,而脂肪酸被认为是益生菌膜外壳5、6的可信候选体。为了形成新膜或促进膜生长,必须从外部7提供两栖积木,或者最好使用相应的合成代谢工艺在膜腔内生产4 ,8.
脂质合成是一个相对复杂的代谢过程,而肽可以很容易地使用无细胞基因表达反应9,10。因此,由两栖肽形成的肽膜是脂质膜的有趣替代品,作为能够生长11的人工细胞模拟的外壳。
嗜血弹性蛋白样二块共聚物(ELPs)是一种有吸引力的肽类,它可以作为这种膜12的构建基块。ELPs的基本氨基酸序列图案是(GaGVP)n,其中”a”可以是除proline以外的任何氨基酸,”n”是主题重复的数量13,14,15,16,17.ELPs已经创建与主要含有苯丙氨酸a和亲水性块主要由谷氨酸11组成的疏水块。根据和溶液参数(如pH和盐浓度),ELPs在温度Tt下表现出所谓的逆温过渡,其中肽经历了从亲水性到疏水性完全可逆的相变状态。使用”TX-TL”细菌细胞提取物11、18、19、20、21,在囊泡内轻松实现肽的合成,这提供了耦合转录和翻译反应所需的所有组件。
TX-TL系统封装在一起,DNA模板利用玻璃珠的脱水补液将ELP编码到ELP囊泡中作为固体支撑。囊泡的形成是通过从珠表面11的干肽的补液而形成的。可以使用其他方法22用于囊泡形成,这可能显示较低的多分散度和较大的囊泡尺寸(例如,电形成、乳液相转移或基于微流体的方法)。为了测试封装方法的可行性,荧光能的转录法dBroccoli2可以交替使用11,这比TX-TL系统的基因表达要复杂。
由于囊泡中膜积块的表达及其随后的加入膜,囊泡开始生长11。ELP的膜结合可以通过FRET测定进行演示。为此,用于形成初始囊泡总体的 ELPs 与构成 FRET 对的相等份额中的荧光染料结合使用。当在囊泡中表达未标记的ELP并将其并融入膜中时,膜中标记的ELP被稀释,因此FRET信号减小11。铜催化阿齐德-烷基环增法是一种通用且常见的结合方法。使用稳定配体,如三s(苯基苯甲酰乙-胺),反应可以在生理pH的水溶液中进行,无需水解反应物11,这适用于结合反应涉及肽。
以下协议详细介绍了生长基于ELP的肽类的制备情况。介绍了使用玻璃珠法的肽和囊泡形成表达式。此外,还介绍了如何实现氟化德布罗图阿图默的转录和ELP囊泡内蛋白质表达的转录-翻译反应。最后,提供了一个ELPs与荧光荧光的结合程序,它可以用来通过FRET测定11来证明囊泡的生长。
薄膜补液是创建小型单片囊泡的常见程序。故障的主要来源是对程序中使用的材料处理错误。
最初,ELPs由大肠杆菌细胞产生。ELP 纯化后的产量可能有很大差异,具体取决于协议在关键步骤中执行的谨慎程度。这些是逆温循环 (ITC) 步骤和降水后 ELP 的重新悬浮。为了纯化,我们通过添加磷酸触发了肽的疏水性崩溃,磷酸将pH?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢通过DFG TRR 235(生命出现,项目P15)、欧洲研究理事会(赠款协议694410 AEDNA)和TUM国际科学与工程研究生院IGSSE(项目9.05)提供的财政支持。.我们感谢E.Falgenhauer在样品制备方面的帮助。我们感谢A.杜平和M.施瓦茨-席林在TX-TL系统和有益的讨论方面所做的帮助。我们感谢荷兰进行了有益的讨论。
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
DNase I | NEB | M0303S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
methanol | Carl Roth | 82.2 | |
MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
rNTP | NEB | N0466S | |
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
T7 polymerase | NEB | M0251S | |
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 |