I Vesiculo syntese av peptid membran forløpere for autonome vesicle vekst
Summary
Presentert her er protokoller for etablering av peptid-baserte små unilamellære blemmer i stand til vekst. For å lette i vesiculo produksjon av membranen peptid, disse blemmer er utstyrt med en transkripsjon-oversettelse system og peptid-koding plasmider.
Abstract
Compartmentalization av biokjemiske reaksjoner er et sentralt aspekt av syntetiske celler. For dette formålet, peptid-baserte reaksjons rom fungerer som et attraktivt alternativ til liposomer eller fatty acid-baserte blemmer. Eksternt eller innenfor blemmer, kan peptider enkelt uttrykkes og forenkle syntesen av membran forløpere. Forutsatt her er en protokoll for etablering av blemmer med diametere på ~ 200 nm basert på amfifile elastin-lignende polypeptider (ELP) utnytte dehydrering-rehydrering fra glassperler. Også presentert er protokoller for bakteriell ELP uttrykk og rensing via inverse temperatur sykling, samt deres kovalente funksjonalisering med fluorescerende fargestoffer. Videre beskriver denne rapporten en protokoll for å muliggjøre transkripsjon av RNA aptamer dBroccoli innsiden ELP blemmer som et mindre komplekst eksempel for en biokjemiske reaksjon. Til slutt, en protokoll er gitt, som tillater i vesiculo uttrykk for fluorescerende proteiner og membranen peptid, mens syntese av sistnevnte resulterer i vesicle vekst.
Introduction
Opprettelsen av syntetiske levende cellulære systemer er vanligvis nærmet seg fra to forskjellige retninger. I top-down metoden, er det Genova av en bakterie redusert til sine essensielle komponenter, til slutt fører til en minimal celle. I nedenfra og opp tilnærming, er kunstige celler montert de Novo fra molekylære komponenter eller cellulære delsystemer, som må være funksjonelt integrert i en konsistent celle-lignende system.
I de Novo tilnærming, compartmentalization av de nødvendige biokjemiske komponentene er vanligvis oppnås ved hjelp av membraner laget av fosfolipider eller fettsyrer1,2,3,4. Dette er fordi “moderne” cellemembraner hovedsakelig består av fosfolipider, mens fettsyrer anses sannsynlig kandidater av prebiotiske membran vedlegg5,6. For dannelsen av nye membraner eller for å lette membran vekst, amfifile byggesteinene må gis fra utsiden7 eller ideelt gjennom produksjon i en membranous kupé med tilsvarende anabole prosesser4 ,8.
Mens lipid syntese er en relativt komplisert metabolske prosessen, kan peptider produseres ganske lett ved hjelp av Cell-Free genuttrykk reaksjoner9,10. Derav, peptid membraner dannet av amfifile peptider representerer et interessant alternativ til lipid membraner som kabinetter for kunstig celle etterligner som er i stand til å vokse11.
Amfifile elastin-lignende di-Block kopolymerer (ELPs) er en attraktiv klasse av peptider, som kan tjene som byggekloss for slike membraner12. Den grunnleggende aminosyren sekvens motiv av ELPs er (GaGVP)n, der “a” kan være noen aminosyre unntatt proline og “n” er antall motiv gjentar13,14, 15,16,17 . ELPs har blitt opprettet med en hydrofobe blokk som inneholder hovedsakelig fenylalanin for en og en hydrofile blokk hovedsakelig sammensatt av Glutaminsyre acid11. Avhengig av en og løsnings parametere, for eksempel pH-og saltkonsentrasjon, viser ELPs en såkalt invers temperatur overgang ved temperatur Tt, der peptider gjennomgår en fullstendig reversibel faseovergang fra en hydrofile til hydrofobe Staten. Syntesen av peptider kan enkelt implementeres inne blemmer ved hjelp av “TX-TL” bakteriell Cell Extract11,18, 19,20,21, som gir alle nødvendige komponenter for kombinert transkripsjon og oversettelse reaksjoner.
TX-TL-systemet ble innkapslet sammen, med DNA-mal kodingen ELPs i ELP blemmer utnytte dehydrering-rehydrering fra glassperler som en solid støtte. Dannelsen av blemmer oppstår gjennom rehydrering av tørkede peptider fra perle overflaten11. Andre metoder22 for vesicle formasjon kan brukes, som potensielt viser lavere polydispersitet og større vesicle størrelser (for eksempel elektro-formasjon, emulsjon faseoverføring, eller materialer-baserte metoder). For å teste levedyktigheten til innkapsling metoden, transkripsjon av fluorogenic aptamer dBroccoli23 kan alternativt brukes11, som er mindre komplisert enn genuttrykk med TX-TL-systemet.
På grunn av uttrykket av membranen byggesteinene i vesiculo og deres påfølgende innlemmelse i membranen, begynner blemmer å vokse11. Membran innlemmelse av ELPs kan påvises gjennom et bånd analysen. For dette formål, ELPs brukes til dannelsen av den opprinnelige vesicle befolkningen blir bøyd med fluorescerende fargestoffer i like deler utgjør et bånd par. Ved uttrykk for ikke-merket ELPs i vesiculo og deres innlemmelse i membranen, er merket ELPs i membranen fortynnet og følgelig bånd signalet synker11. Som en allsidig og vanlig metode for Bøyning, brukes kobber katalysert Natriumazid-alkyne sykloaddisjonsreaksjoner. Med bruk av en stabiliserende ligand som Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin, kan reaksjonen utføres i en vandig løsning på en fysiologisk pH uten hydrolyse av reaktantene11, som er hensiktsmessig for Bøyning reaksjoner som involverer peptider.
Følgende protokoll presenterer en detaljert beskrivelse av forberedelsene til voksende ELP-baserte peptidosomes. Uttrykket av peptider og vesicle formasjon ved hjelp av glassperler metoden er beskrevet. Videre er det beskrevet hvordan du implementerer transkripsjon av fluorogenic dBroccoli aptamer og transkripsjon-oversettelse reaksjon for protein uttrykk inne i ELP blemmer. Til slutt, forutsatt er en prosedyre for Bøyning av ELPs med fluorophores, som kan brukes til å bevise vesicle vekst gjennom et bånd analysen11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Film rehydrering er en vanlig prosedyre for etablering av små unilamellære blemmer. Den viktigste kilden til svikt er feil håndtering av materialene som brukes i prosedyren.
I utgangspunktet er ELPs produsert av E. coli celler. Avkastningen etter at ELP rensing kan variere betydelig avhengig av hvor nøye protokollen er gjennomført i løpet av sin avgjørende trinn. Dette er den inverse temperatur sykling (ITC) tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker takknemlig finansiell støtte gjennom DFG TRR 235 (fremveksten av Life, prosjekt P15), European Research Council (Grant avtalen nr. 694410 AEDNA), og TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (prosjekt nr. 9,05) . Vi takker E. Falgenhauer for hennes hjelp med prøven forberedelse. Vi takker A. Dupin og M. Schwarz-Schilling for deres hjelp med TX-TL-systemet og nyttige diskusjoner. Vi takker N. B. Holland for nyttige diskusjoner.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
