In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei
Summary
Hier gepresenteerd zijn protocollen voor de creatie van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire blaasjes in staat van groei. Om de vesiculo productie van het membraan peptide te vergemakkelijken, zijn deze blaasjes uitgerust met een transcriptie-vertaalsysteem en de peptide-encoding plasmide.
Abstract
Compartimenalisatie van biochemische reacties is een centraal aspect van synthetische cellen. Voor dit doel, peptide-gebaseerde reactie compartimenten dienen als een aantrekkelijk alternatief voor liposomen of vetzuur gebaseerde vesicles. Uitwendig of binnen de blaasjes kunnen peptiden gemakkelijk worden uitgedrukt en de synthese van membraan precursoren vereenvoudigen. Hier is een protocol voor het maken van blaasjes met diameters van ~ 200 nm gebaseerd op de amfifiele elastïne-achtige polypeptiden (ELP) met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas kralen. Ook zijn de protocollen voor bacteriële ELP expressie en zuivering via inverse temperatuur fietsen, evenals hun covalente functionalisatie met fluorescerende kleurstoffen. Bovendien beschrijft dit verslag een protocol om de transcriptie van RNA aptamer dBroccoli in ELP-blaasjes als een minder complex voorbeeld voor een biochemische reactie mogelijk te maken. Ten slotte wordt een protocol verstrekt, dat toelaat in vesiculo expressie van fluorescerende eiwitten en het membraan peptide, terwijl de synthese van de laatste resulteert in vesikel groei.
Introduction
De creatie van synthetische levende cellulaire systemen wordt meestal benaderd vanuit twee verschillende richtingen. In de top-down methode wordt het genoom van een bacterie gereduceerd tot de essentiële componenten, wat uiteindelijk leidt tot een minimale cel. In de bottom-up benadering, worden kunstmatige cellen geassembleerd de Novo van moleculaire componenten of cellulaire subsystemen, die functioneel moeten worden geïntegreerd in een consistente cel-achtige systeem.
In de de Novo aanpak wordt de compartimenlise ring van de noodzakelijke biochemische componenten meestal bereikt met behulp van membranen gemaakt van fosfolipiden of vetzuren1,2,3,4. Dit komt omdat “moderne” celmembranen voornamelijk bestaan uit fosfolipiden, terwijl vetzuren worden beschouwd als plausibele kandidaten van prebiotische membraanbehuizingen5,6. Voor de vorming van nieuwe membranen of om membraan groei te vergemakkelijken, moeten amfifiele bouwstenen worden geleverd vanaf de buitenkant7 of idealiter door productie binnen een membraneus compartiment met behulp van de overeenkomstige anabole processen4 ,8.
Hoewel lipide-synthese een relatief complex metabolisch proces is, kunnen peptiden vrij gemakkelijk worden geproduceerd met behulp van celvrije genexpressie-reacties9,10. Vandaar, peptide membranen gevormd door amfifiele peptiden vertegenwoordigen een interessant alternatief voor lipide membranen als Behuizingen voor kunstmatige cel nabootst die in staat zijn om te groeien11.
Amfifiele elastïne-achtige di-Block copolymeren (Elp’s) zijn een aantrekkelijke klasse van peptiden, die als bouwsteen voor dergelijke membranen12kunnen dienen. Het basis aminozuursequentie motief van ELPs is (gagvp)n, waarbij “a” elk aminozuur kan zijn behalve Proline en “n” het aantal motief herhalingen13,14,15,16,17 . Elp’s zijn gemaakt met een hydrofoob blok met voornamelijk fenylalanine voor a en een hydrofiel blok, voornamelijk samengesteld uit glutaminezuur11. Afhankelijk van een parameter en oplossings parameters, zoals pH en zoutconcentratie, vertonen Elp’s een zogenaamde inverse temperatuur overgang bij temperatuur Tt, waarbij de peptiden een volledig omkeerbare faseovergang ondergaan van een hydrofiele naar hydrofobe Staat. De synthese van de peptiden kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in blaasjes met behulp van de “TX-TL” bacteriële cel extract11,18,19,20,21, die biedt alle benodigde componenten voor gekoppelde transcriptie-en vertaal reacties.
Het TX-TL-systeem werd samen ingekapseld, met de DNA-sjabloon die de Elp’s codeert in ELP-blaasjes met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas parels als een solide ondersteuning. De vorming van blaasjes gebeurt door rehydratatie van de gedroogde peptiden van het kraal oppervlak11. Andere methoden22 voor de vorming van blaasje kunnen worden gebruikt, die mogelijk een lagere polydispersiteit en grotere blaasje grootten vertonen (bijv. elektro vorming, emulsie faseoverdracht of microfluidics-gebaseerde methoden). Om de levensvatbaarheid van de inkapings methode te testen, kan een transcriptie van de fluorogene aptamer dBroccoli23 ook worden gebruikt11, wat minder complex is dan GENEXPRESSIE met het TX-TL-systeem.
Door de expressie van de membraan bouwstenen in vesiculo en hun daaropvolgende opname in het membraan, beginnen de blaasjes11te groeien. Membraan opname van de Elp’s kan worden aangetoond door middel van een FRET assay. Daartoe worden de elp’s die worden gebruikt voor de vorming van de initiële blaasje populatie geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen in gelijke delen die een fret paar vormen. Na expressie van niet-gelabelde Elp’s in vesiculo en hun opname in het membraan, worden de gelabelde Elp’s in het membraan verdund en bijgevolg daalt het FRET-signaal11. Als een veelzijdige en gemeenschappelijke methode voor conjugatie, koper gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie wordt gebruikt. Met het gebruik van een stabiliserende ligand zoals tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, kan de reactie worden uitgevoerd in een waterige oplossing met een fysiologische pH zonder de hydrolyse van reactanten11, die geschikt is voor conjugatie reacties waarbij peptiden betrokken zijn.
Het volgende protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding op het kweken van peptidosomes op basis van ELP. De uitdrukking van de peptiden en vesikel vorming met behulp van de glas kralen methode wordt beschreven. Bovendien wordt beschreven hoe u de transcriptie van de fluor Gene dBroccoli aptamer en de transcriptie-Vertaal reactie voor eiwit expressie in de ELP-blaasjes implementeert. Tot slot is er een procedure voor de conjugatie van Elp’s met fluoroforen, die kan worden gebruikt om de groei van de vesikel te bewijzen door middel van een FRET assay11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Film rehydratie is een veelgebruikte procedure voor het maken van kleine unilamellaire blaasjes. De belangrijkste bron van falen is de verkeerde omgang met de materialen die in de procedure worden gebruikt.
In eerste instantie worden de Elp’s geproduceerd door E. coli cellen. De opbrengst na de zuivering van de ELP kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van hoe zorgvuldig het protocol wordt uitgevoerd tijdens de cruci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen financiële steun via de DFG TRR 235 (opkomst van Life, project P15), de Europese Onderzoeksraad (subsidieovereenkomst nr. 694410 AEDNA) en de TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (project nr. 9,05) . Wij danken E. Falgenhauer voor haar hulp met monstervoorbereiding. We bedanken A. Dupin en M. Schwarz-Schilling voor hun hulp bij het TX-TL-systeem en nuttige discussies. Wij danken N. B. Holland voor nuttige discussies.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
