In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola
Summary
Qui sono presentati protocolli per la creazione di piccole vescibole unilamellar a base di peptidi in grado di crescere. Per facilitare la produzione vesiculo del peptide della membrana, queste vesciche sono dotate di un sistema di traduzione della trascrizione e del plasmide di codifica dei peptidi.
Abstract
La compartimentazione delle reazioni biochimiche è un aspetto centrale delle cellule sintetiche. A questo scopo, i compartimenti di reazione basati su peptidi servono come alternativa attraente ai liposomi o alle vesciche a base di acidi grassi. Esternamente o all’interno delle vesciche, i peptidi possono essere facilmente espressi e semplificare la sintesi dei precursori della membrana. Fornito qui è un protocollo per la creazione di vesciche con diametri di 200 nm sulla base dei polipeptidi elastina-come anfilici (ELP) utilizzando la disidratazione-reidratazione da perline di vetro. Sono inoltre presentati protocolli per l’espressione e la purificazione batterica degli ELP attraverso il ciclo della temperatura inversa, nonché la loro funzionalizzazione covalente con coloranti fluorescenti. Inoltre, questo rapporto descrive un protocollo per consentire la trascrizione dell’RNA aptamer dBroccoli all’interno delle vescicle ELP come esempio meno complesso per una reazione biochimica. Infine, viene fornito un protocollo, che consente in vesiculo espressione delle proteine fluorescenti e del peptide della membrana, mentre la sintesi di quest’ultimo si traduce nella crescita vescicale.
Introduction
La creazione di sistemi cellulari viventi sintetici è di solito avvicinata da due direzioni diverse. Nel metodo top-down, il genoma di un batterio è ridotto ai suoi componenti essenziali, portando in ultima analisi ad una cellula minima. Nell’approccio bottom-up, le cellule artificiali sono assemblate de novo da componenti molecolari o sottosistemi cellulari, che devono essere integrati funzionalmente in un sistema coerente simile a una cellula.
Nell’approccio de novo, la compartimentazione dei componenti biochimici necessari è solitamente ottenuta utilizzando membrane a base di fosfolipidi o acidi grassi1,2,3,4. Questo perché le membrane cellulari “moderne” sono costituite principalmente da fosfolipidi, mentre gli acidi grassi sono considerati candidati plausibili di recinti di membrana prebiotica5,6. Per la formazione di nuove membrane o per facilitare la crescita della membrana, gli elementi costitutivi anfilici devono essere forniti dall’esterno7 o idealmente attraverso la produzione all’interno di un vano membranoutilizzando utilizzando i corrispondenti processi anabolizzanti4 ,8.
Mentre la sintesi dei lipidi è un processo metabolico relativamente complesso, i peptidi possono essere prodotti abbastanza facilmente utilizzando reazioni di espressione genica prive di cellule9,10. Quindi, le membrane peptidiche formate da peptidi anfifile rappresentano un’interessante alternativa alle membrane lipidiche come recinti per imitazioni cellulari artificiali che sono in grado di crescere11.
I copolimeri anfifici simili all’elastina (ELP) sono una classe attraente di peptidi, che può fungere da elemento costitutivo per tali membrane12. Il motivo di base della sequenza di amminoacidi di ELPs è (GaGVP)n, dove “a” può essere qualsiasi aminoacido ad eccezione della prolina e “n” è il numero di ripetizioni motif13,14,15,16,17 . ELP sono stati creati con un blocco idrofobico contenente principalmente fenilalanina per un e un blocco idrofilo composto principalmente da acido glutammico11. A seconda dei parametri di una e soluzione, come la concentrazione di pH e sale, gli ELP presentano una cosiddetta transizione di temperatura inversa alla temperatura Tt, dove i peptidi subiscono una transizione di fase completamente reversibile da un idrofilo all’idrofobico stato. La sintesi dei peptidi può essere facilmente implementata all’interno di vesciche utilizzando l’estratto di cellule batteriche “TX-TL”11,18,19,20,21, che fornisce tutti i componenti necessari per le reazioni di trascrizione e traduzione accoppiate.
Il sistema TX-TL è stato incapsulato insieme, con il modello di DNA che codifica gli ELP nelle vescicoli ELP utilizzando la reidratazione-reidratazione dalle perline di vetro come supporto solido. La formazione di vescicle avviene attraverso la reidratazione dei peptidi secchi dalla superficie del tallone11. Possono essere utilizzati altri metodi22 per la formazione di vescicoli, che potenzialmente mostrano una minore polidispersione e dimensioni vesciche più grandi (ad esempio, elettro-formazione, trasferimento di fase di emulsione o metodi basati sulla microfluidica). Per testare la fattibilità del metodo di incapsulamento, la trascrizione dell’aptamer fluorogenico dBroccoli23 può essere utilizzata in alternativa11, che è meno complessa dell’espressione genica con il sistema TX-TL.
A causa dell’espressione dei mattoni della membrana in vesiculo e la loro successiva incorporazione nella membrana, le vesciche iniziano a crescere11. L’incorporazione di membrane degli ELP può essere dimostrata attraverso un saggio FRET. A tal fine, gli ELP utilizzati per la formazione della popolazione vescicana iniziale sono coniugati con coloranti fluorescenti in parti uguali che costizzano una coppia FRET. Dopo l’espressione di ELP non etichettati in vesiculo e la loro incorporazione nella membrana, gli ELP etichettati nella membrana vengono diluiti e di conseguenza il segnale FRET diminuiscedi 11. Come metodo versatile e comune per la coniugazione, viene utilizzato la cicloaddition azide-alkyne catalizzata in rame. Con l’uso di un legamento stabilizzante come tris(benzyltriazolylmethyl)-ammine, la reazione può essere effettuata in una soluzione acquosa a un pH fisiologico senza l’idrolisi dei reanti11, che è appropriato per le reazioni di coniugazione peptidi.
Il seguente protocollo presenta una descrizione dettagliata della preparazione per i peptidosos a base di ELP. Viene descritta l’espressione dei peptidi e della formazione di velecle utilizzando il metodo delle perline di vetro. Inoltre, viene descritto come implementare la trascrizione dell’aptamer fluorogenico dBroccoli e la reazione trascrizione-traduzione per l’espressione proteica all’interno delle vesciche ELP. Infine, è fornita una procedura per la coniugazione di ELP con fluorofori, che può essere utilizzato per dimostrare la crescita vescicale attraverso un analisi FRET11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reidratazione delle pellicole è una procedura comune per la creazione di piccole vesciche unilamellar. La principale fonte di guasto è la gestione errata dei materiali utilizzati nella procedura.
Inizialmente, gli ELP sono prodotti dalle cellule E. coli. La resa dopo la purificazione dell’ELP può variare in modo significativo a seconda di quanto attentamente il protocollo viene condotto durante i suoi passi cruc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario attraverso il DFG TRR 235 (Emergence of Life, progetto P15), il Consiglio europeo della ricerca (accordo di sovvenzione n. 694410 AEDNA) e la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (progetto n. 9.05) . Ringraziamo E. Falgenhauer per il suo aiuto con la preparazione del campione. Ringraziamo A. Dupin e M. Schwarz-Schilling per il loro aiuto con il sistema TX-TL e discussioni utili. Ringraziamo N. B. Holland per discussioni utili.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
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