I Vesiculo-syntesen af Peptidmembranprækursorer til autonom vesikel vækst
Summary
Præsenteret her er protokoller til oprettelse af peptid-baserede små af vesikler i stand til vækst. For at lette vesiculo produktion af membranen peptid, disse vesikler er udstyret med en transskription-oversættelse system og peptid-kodning plasmid.
Abstract
Opdeling af biokemiske reaktioner er et centralt aspekt af syntetiske celler. Til dette formål tjener peptidbaserede reaktions segmenter som et attraktivt alternativ til Liposomer eller fedtsyre baserede vesikler. Eksternt eller inden for vesicles, peptider kan let udtrykkes og forenkle syntesen af membran prækursorer. Forudsat her er en protokol til oprettelse af vesikler med diametre på ~ 200 Nm baseret på amfifile elastin-lignende polypeptider (ELP) udnytte dehydrering-rehydrering fra glasperler. Også præsenteret er protokoller for bakteriel ELP udtryk og rensning via inverse temperatur cykling, samt deres kovalente funktionalisering med fluorescerende farvestoffer. Desuden beskriver denne rapport en protokol, der gør det muligt at transkriptionen af RNA-aptamer dBroccoli i ELP-vesikler som et mindre komplekst eksempel på en biokemisk reaktion. Endelig er der en protokol, som giver mulighed for vesiculo ekspression af fluorescerende proteiner og membran peptid, mens syntesen af sidstnævnte resulterer i vesikel vækst.
Introduction
Skabelsen af syntetiske levende cellulære systemer er normalt gribes an fra to forskellige retninger. I top-down-metoden reduceres genomet af en bakterie til dens væsentlige bestanddele, hvilket i sidste ende fører til en minimal celle. I bottom-up-tilgangen samles kunstige celler de Novo fra molekylære komponenter eller cellulære delsystemer, som skal integreres funktionelt i et ensartet celle lignende system.
I de Novo-tilgangen opnås der sædvanligvis afskærmning af de nødvendige biokemiske komponenter ved hjælp af membraner fremstillet af phospholipider eller fedtsyrer1,2,3,4. Dette skyldes, at “moderne” cellemembraner hovedsageligt består af phospholipider, mens fedtsyrer betragtes som plausible kandidater af prebiotiske membran kabinetter5,6. For dannelsen af nye membraner eller for at lette membran vækst, skal amfifile byggeklodser leveres fra det udvendige7 eller ideelt gennem produktion i et membranøs rum ved hjælp af de tilsvarende anabolske processer4 ,8.
Mens lipid syntese er en relativt kompleks metabolisk proces, peptider kan produceres ganske let ved hjælp af celle-fri genekspression reaktioner9,10. Derfor, peptid membraner dannet af amfifile peptider repræsenterer et interessant alternativ til lipid membraner som kabinetter for kunstig celle efterligner, der er i stand til at vokse11.
Amphiphilic elastin-lignende di-Block copolymerer (ELPs) er en attraktiv klasse af peptider, som kan tjene som byggesten for sådanne membraner12. Den grundlæggende aminosyresekvens motiv af ELPs er (gagvp)n, hvor “a” kan være enhver aminosyre bortset fra prolin og “n” er antallet af motiv gentagelser13,14,15,16,17 . Elp’er er blevet oprettet med en hydrofobe blok, der hovedsagelig indeholder phenylalanin for a og en hydrofile blok, som hovedsagelig består af glutaminsyre11. Afhængigt af a-og Solution-parametrene, såsom pH-og saltkoncentration, udviser ELPs en såkaldt omvendt temperatur overgang ved temperatur Tt, hvor peptiderne gennemgår en fuldt reversibel faseovergang fra en hydrofile til hydrofobe Staten. Syntesen af peptider kan let implementeres inde vesikler ved hjælp af “TX-TL” bakteriel celle ekstrakt11,18,19,20,21, som giver alle nødvendige komponenter til koblede transskription og oversættelses reaktioner.
TX-TL-systemet blev indkapslet sammen, med DNA-skabelonen, der koder ELPs i ELP-vesikler, der udnytter dehydrering-rehydrering fra glasperler som en solid støtte. Dannelsen af vesikler sker gennem rehydrering af de tørrede peptider fra perlerne overflade11. Andre metoder22 til vesikel dannelse kan anvendes, som potentielt viser lavere polydispersitet og større vesikle størrelser (f. eks. Elektro dannelse, overførsel af emulsions fase eller mikrofluidics-baserede metoder). For at afprøve indkapsling metodens levedygtighed kan transkriptionen af den fluorogene aptamer dBroccoli23 alternativt anvendes11, hvilket er mindre komplekst end genekspression med TX-TL-systemet.
På grund af ekspression af membranen byggesten i vesiculo og deres efterfølgende inkorporering i membranen, begynder vesikler at vokse11. Membran inkorporering af ELPs kan påvises gennem en FRET analyse. Til dette formål er de Elp’er, der anvendes til dannelse af den oprindelige vesikle population, konjugeret med fluorescerende farvestoffer i lige store dele, som udgør et FRET pair. Ved ekspression af ikke-mærkede Elp’er i vesiculo og deres inkorporering i membranen, fortyndes de mærkede Elp’er i membranen, og derfor falder FRET-signalet11. Som en alsidig og almindelig metode til konjugering anvendes kobberkatalyseret Azid-alkyne cycloaddition. Ved brug af en stabiliserende ligand såsom tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin kan reaktionen udføres i en vandig opløsning ved en fysiologisk pH-værdi uden hydrolyse af reactanter11, hvilket er passende for konjugering reaktioner involverer peptider.
Følgende protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af forberedelsen til dyrkning af ELP-baserede peptidosomer. Udtrykket af peptider og vesikel dannelse ved hjælp af glasperler metode er beskrevet. Desuden er det beskrevet, hvordan man implementerer transkriptionen af den fluorogene dBroccoli aptamer og transskription-oversættelse reaktion for protein ekspression inde i ELP vesikler. Endelig er der fastsat en procedure for konjugering af Elp’er med fluorophorer, som kan bruges til at påvise vesikel vækst gennem en FRET-analyse11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Film rehydrering er en fælles procedure for oprettelse af små af vesikler. Den vigtigste kilde til fiasko er den forkerte håndtering af de materialer, der anvendes i proceduren.
I første omgang ELPs produceres af E. coli celler. Udbyttet efter ELP rensning kan variere betydeligt afhængigt af, hvor omhyggeligt protokollen er gennemført i løbet af sine afgørende skridt. Disse er den inverse temperatur cykling (I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender taknemmeligt finansiel støtte gennem DFG TRR 235 (fremkomsten af Life, Project P15), det Europæiske Forskningsråd (tilskudsaftale nr. 694410 AEDNA) og TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projekt nr. 9,05) . Vi takker E. Falgenhauer for hendes hjælp med prøveforberedelse. Vi takker A. Dupin og M. Schwarz-Schilling for deres hjælp med TX-TL systemet og nyttige diskussioner. Vi takker N. B. Holland for nyttige diskussioner.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
