Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.
A compartimentação das reações bioquímicas é um aspecto central das células sintéticas. Para esta finalidade, os compartimentos peptídicos da reação servem como uma alternativa atrativa aos lipossomas ou aos vesicles ácidos gordos-baseados. Externamente ou dentro das vesículas, os peptídeos podem ser facilmente expressos e simplificar a síntese de precursores de membrana. Fornecido aqui é um protocolo para a criação de vesículas com diâmetros de ~ 200 nm com base no anfífilo elastina-como polipeptídeos (ELP) utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro. Também são apresentados protocolos para a expressão e purificação de ELP bacteriana através de ciclagem de temperatura inversa, bem como a sua funcionalização covalente com corantes fluorescentes. Além disso, este relatório descreve um protocolo para permitir a transcrição de dbrócolos do aptâmeros do RNA dentro dos vesículas de ELP como um exemplo menos complexo para uma reação bioquímica. Finalmente, um protocolo é fornecido, que permite na expressão do vesicobolhosas de proteínas fluorescentes e do peptide da membrana, visto que a síntese do último conduz ao crescimento do vesícula.
A criação de sistemas celulares vivos sintéticos é geralmente abordada a partir de duas direções diferentes. No método de cima para baixo, o genoma de uma bactéria é reduzido aos seus componentes essenciais, em última análise, levando a uma célula mínima. Na aproximação bottom-up, as pilhas artificiais são montadas de novo dos componentes moleculars ou dos subsistemas celulares, que precisam de ser integrados funcionalmente em um sistema cell-like consistente.
Na abordagem de de novo, a compartimentação dos componentes bioquímicos necessários é geralmente alcançada usando membranas feitas de fosfolipídios ou ácidos graxos1,2,3,4. Isso porque as membranas celulares “modernas” consistem principalmente de fosfolipídios, enquanto os ácidos graxos são considerados candidatos plausíveis de gabinetes de membrana prebiótica5,6. Para a formação de membranas novas ou para facilitar o crescimento da membrana, os blocos de construção anfifílico devem ser fornecidos do exterior7 ou idealmente com a produção dentro de um compartimento membranous usando os processos anabólicos correspondentes4 ,8.
Enquanto a síntese lipídica é um processo metabólico relativamente complexo, os peptídeos podem ser produzidos bastante prontamente usando reações de expressão gênica sem células9,10. Assim, as membranas peptídicas formadas por peptídeos anfífilos representam uma alternativa interessante para as membranas lipídicas como compartimentos para mímica de células artificiais que são capazes de crescer11.
Os copolímeros de di-bloco de elastina (ELPs) anfífilos são uma classe atrativa de peptídeos, que pode servir como o bloco de construção para tais membranas12. O motivo básico da sequência de aminoácidos de ELPS é (gagvp) n, onde “a” pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina e “n” é o número de repetições de motivo13,14,15,16,17 . Os ELPs foram criados com um bloco hidrofóbico contendo principalmente fenilalanina para um e um bloco hidrófilo composto principalmente de ácido glutâmico11. Dependendo de um e parâmetros de solução, como pH e concentração de sal, ELPs exibem uma transição de temperatura inversa chamada na temperatura Tt, onde os peptídeos passam por uma transição de fase totalmente reversível de um hidrofílico para hidrofóbico Estado. A síntese dos peptídeos pode ser facilmente implementada dentro de vesículas usando o extrato de células bacterianas “TX-TL”11,18,19,20,21, que fornece todos os componentes necessários para a transcrição acoplada e reações de tradução.
O sistema TX-TL foi encapsulado em conjunto, com o modelo de DNA codificando os ELPs em vesículas ELP utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro como suporte sólido. A formação de vesículas ocorre por meio da reidratação dos peptídeos secos da superfície do cordão11. Outros métodos22 para a formação de vesículas podem ser usados, que potencialmente apresentam menor polidispersão e tamanhos maiores de vesículas (por exemplo, electro-formação, transferência de fase de emulsão ou métodos baseados em microfluínicos). Para testar a viabilidade do método de encapsulamento, a transcrição do aptâmeros fluorogênico dbrócolos23 pode alternativamente ser usada11, que é menos complexa do que a expressão gênica com o sistema TX-TL.
Devido à expressão dos blocos de construção da membrana no vesicobolhosas e sua incorporação subseqüente na membrana, as vesículas começam a crescer11. A incorporação da membrana dos ELPs pode ser demonstrada através de um ensaio do FRET. Para este fim, os ELPs utilizados para a formação da população de vesículas iniciais são conjugados com corantes fluorescentes em partes iguais constituindo um par FRET. Em cima da expressão de ELPS não-etiquetados no vesicobolhosas e de sua incorporação na membrana, os ELPS etiquetados na membrana são diluídos e consequentemente o sinal do fret diminui11. Como um método versátil e comum para a conjugação, o cicloadição catalisado cobre da azida-alkyne é usado. Com o uso de um ligante estabilizante como a Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amine, a reação pode ser realizada em uma solução aquosa em um pH fisiológico sem a hidrólise de reagentes11, que é apropriado para reações de conjugação envolvendo peptídeos.
O protocolo a seguir apresenta uma descrição detalhada da preparação para o cultivo de peptidosomas baseados em ELP. A expressão dos peptídeos e a formação de vesículas utilizando o método de grânulos de vidro são descritas. Além disso, descreve-se como implementar a transcrição do apdomador fluorogênico de Dbrócolos e a reação de transcrição-tradução para expressão protéica dentro das vesículas do ELP. Finalmente, fornecido é um procedimento para a conjugação de ELPs com fluoróforos, que pode ser usado para provar o crescimento da vesícula através de um ensaio FRET11.
A reidratação do filme é um procedimento comum para a criação de pequenas vesículas unilamelares. A principal fonte de falha é o manuseio incorreto dos materiais utilizados no procedimento.
Inicialmente, os ELPs são produzidos por células de E. coli . O rendimento após a purificação de ELP pode variar significativamente dependendo de como o protocolo é conduzido com cuidado durante suas etapas cruciais. E…
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos com gratidão o apoio financeiro através do DFG TRR 235 (emergence da vida, projeto P15), o Conselho Europeu de investigação (acordo de subvenção n º 694410 AEDNA), e a TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projeto n º 9, 5) . Agradecemos a E. Falgenhauer por sua ajuda com a preparação da amostra. Agradecemos a. Dupin e M. Schwarz-Schilling por sua ajuda com o sistema TX-TL e discussões úteis. Agradecemos a N. B. Holland por discussões úteis.
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
DNase I | NEB | M0303S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
methanol | Carl Roth | 82.2 | |
MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
rNTP | NEB | N0466S | |
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
T7 polymerase | NEB | M0251S | |
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 |