Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Summary

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Abstract

A compartimentação das reações bioquímicas é um aspecto central das células sintéticas. Para esta finalidade, os compartimentos peptídicos da reação servem como uma alternativa atrativa aos lipossomas ou aos vesicles ácidos gordos-baseados. Externamente ou dentro das vesículas, os peptídeos podem ser facilmente expressos e simplificar a síntese de precursores de membrana. Fornecido aqui é um protocolo para a criação de vesículas com diâmetros de ~ 200 nm com base no anfífilo elastina-como polipeptídeos (ELP) utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro. Também são apresentados protocolos para a expressão e purificação de ELP bacteriana através de ciclagem de temperatura inversa, bem como a sua funcionalização covalente com corantes fluorescentes. Além disso, este relatório descreve um protocolo para permitir a transcrição de dbrócolos do aptâmeros do RNA dentro dos vesículas de ELP como um exemplo menos complexo para uma reação bioquímica. Finalmente, um protocolo é fornecido, que permite na expressão do vesicobolhosas de proteínas fluorescentes e do peptide da membrana, visto que a síntese do último conduz ao crescimento do vesícula.

Introduction

A criação de sistemas celulares vivos sintéticos é geralmente abordada a partir de duas direções diferentes. No método de cima para baixo, o genoma de uma bactéria é reduzido aos seus componentes essenciais, em última análise, levando a uma célula mínima. Na aproximação bottom-up, as pilhas artificiais são montadas de novo dos componentes moleculars ou dos subsistemas celulares, que precisam de ser integrados funcionalmente em um sistema cell-like consistente.

Na abordagem de de novo, a compartimentação dos componentes bioquímicos necessários é geralmente alcançada usando membranas feitas de fosfolipídios ou ácidos graxos^1,2,3,4. Isso porque as membranas celulares “modernas” consistem principalmente de fosfolipídios, enquanto os ácidos graxos são considerados candidatos plausíveis de gabinetes de membrana prebiótica^5,6. Para a formação de membranas novas ou para facilitar o crescimento da membrana, os blocos de construção anfifílico devem ser fornecidos do exterior⁷ ou idealmente com a produção dentro de um compartimento membranous usando os processos anabólicos correspondentes^{4 ,8}.

Enquanto a síntese lipídica é um processo metabólico relativamente complexo, os peptídeos podem ser produzidos bastante prontamente usando reações de expressão gênica sem células^9,10. Assim, as membranas peptídicas formadas por peptídeos anfífilos representam uma alternativa interessante para as membranas lipídicas como compartimentos para mímica de células artificiais que são capazes de crescer¹¹.

Os copolímeros de di-bloco de elastina (ELPs) anfífilos são uma classe atrativa de peptídeos, que pode servir como o bloco de construção para tais membranas¹². O motivo básico da sequência de aminoácidos de ELPS é (gagvp) _n, onde “a” pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina e “n” é o número de repetições de motivo^{13,14,15,16,17} . Os ELPs foram criados com um bloco hidrofóbico contendo principalmente fenilalanina para um e um bloco hidrófilo composto principalmente de ácido glutâmico¹¹. Dependendo de um e parâmetros de solução, como pH e concentração de sal, ELPs exibem uma transição de temperatura inversa chamada na temperatura T_t, onde os peptídeos passam por uma transição de fase totalmente reversível de um hidrofílico para hidrofóbico Estado. A síntese dos peptídeos pode ser facilmente implementada dentro de vesículas usando o extrato de células bacterianas “TX-TL”^{11,18,19,20,21}, que fornece todos os componentes necessários para a transcrição acoplada e reações de tradução.

O sistema TX-TL foi encapsulado em conjunto, com o modelo de DNA codificando os ELPs em vesículas ELP utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro como suporte sólido. A formação de vesículas ocorre por meio da reidratação dos peptídeos secos da superfície do cordão¹¹. Outros métodos²² para a formação de vesículas podem ser usados, que potencialmente apresentam menor polidispersão e tamanhos maiores de vesículas (por exemplo, electro-formação, transferência de fase de emulsão ou métodos baseados em microfluínicos). Para testar a viabilidade do método de encapsulamento, a transcrição do aptâmeros fluorogênico dbrócolos²³ pode alternativamente ser usada¹¹, que é menos complexa do que a expressão gênica com o sistema TX-TL.

Devido à expressão dos blocos de construção da membrana no vesicobolhosas e sua incorporação subseqüente na membrana, as vesículas começam a crescer¹¹. A incorporação da membrana dos ELPs pode ser demonstrada através de um ensaio do FRET. Para este fim, os ELPs utilizados para a formação da população de vesículas iniciais são conjugados com corantes fluorescentes em partes iguais constituindo um par FRET. Em cima da expressão de ELPS não-etiquetados no vesicobolhosas e de sua incorporação na membrana, os ELPS etiquetados na membrana são diluídos e consequentemente o sinal do fret diminui¹¹. Como um método versátil e comum para a conjugação, o cicloadição catalisado cobre da azida-alkyne é usado. Com o uso de um ligante estabilizante como a Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amine, a reação pode ser realizada em uma solução aquosa em um pH fisiológico sem a hidrólise de reagentes¹¹, que é apropriado para reações de conjugação envolvendo peptídeos.

O protocolo a seguir apresenta uma descrição detalhada da preparação para o cultivo de peptidosomas baseados em ELP. A expressão dos peptídeos e a formação de vesículas utilizando o método de grânulos de vidro são descritas. Além disso, descreve-se como implementar a transcrição do apdomador fluorogênico de Dbrócolos e a reação de transcrição-tradução para expressão protéica dentro das vesículas do ELP. Finalmente, fornecido é um procedimento para a conjugação de ELPs com fluoróforos, que pode ser usado para provar o crescimento da vesícula através de um ensaio FRET¹¹.

Protocol

1. expressão de polipeptídeos semelhantes à elastina Dia 1: preparação de uma cultura inicial e suprimentos para a expressão peptídica Preparar e autoclave expressão frascos de cultura (4 x 2,5 L) e 3 L de LB médio. Para 1 L de meio LB, adicione 25 g de pó LB a 1 L de água ultrapura. Prepare uma cultura inicial com 100 mL de meio LB, 50 μL de solução de cloranfenicol (filtro de 0,22 μm) estéril-filtrada (25 mg/mL em EtOH) e 50 μL de solução de carbenicili…

Representative Results

Produção de vesículasA Figura 1 mostra imagens de microscopia eletrônica de transmissão (Met) de vesículas preparadas com diferentes soluções de inchaço e o método de grânulos de vidro (ver também VOGELE et al.11). Para a amostra na Figura 1a, apenas a PBS foi utilizada como solução de inchaço para comprovar a formação de vesículas e determinar seu tamanho. Quando a TX-TL foi utilizada como solução…

Discussion

A reidratação do filme é um procedimento comum para a criação de pequenas vesículas unilamelares. A principal fonte de falha é o manuseio incorreto dos materiais utilizados no procedimento.

Inicialmente, os ELPs são produzidos por células de E. coli . O rendimento após a purificação de ELP pode variar significativamente dependendo de como o protocolo é conduzido com cuidado durante suas etapas cruciais. E…

Materials

2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tube	VWR	733-2478
alkine-conjugated Cy3	Sigma-Aldrich	777331
alkine-conjugated Cy5	Sigma-Aldrich	777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
benzamidin	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli strain	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
carbenicillin	Carl Roth	6344.2
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
chloramphenicol	Carl Roth	3886.3
chloroform	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNase I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Ethanol	Carl Roth	9065.2
Folinic acid	Sigma-Aldrich	F7878
Glass beads, acid-washed	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside )	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149
LB Broth	Carl Roth	X968.2
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
methanol	Carl Roth	82.2
MgCl2	Carl Roth	KK36.3
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263.2
pH stripes	Carl Roth	549.2
phenylmethylsulfonyl fluoride	Carl Roth	6367.2
phosphate-buffered saline	VWR	76180-684
phosphoric acid	Sigma-Aldrich	W290017
polyethyleneimine	Sigma-Aldrich	408727
Potassium phosphate dibasic solution	Sigma-Aldrich	P8584
Potassium phosphate monobasic solution	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
RNAPol reaction buffer	NEB	B9012
RNase inhibitor murine	NEB	M0314S
RNaseZap Wipes	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carlroth	A156.1
RTS Amino Acid Sampler	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
sodium chloride	Carl Roth	9265.1
sodium hydroxide	Carl Roth	8655.1
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
sterile-filtered (0.22 µm filter)	Carl Roth	XH76.1
T7 polymerase	NEB	M0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C4706
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (from E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
UTP	USB	23160