Культивирование морской пелагической туникате Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) для экспериментальных исследований
Summary
Долиолиды, в том числе вид Dolioletta gegenbauri,являются небольшими желатиновым морским зоопланктоном экологического значения, встречаемым на продуктивных субконтинентальных шельфовых системах по всему миру. Трудность культивирования этих деликатных организмов ограничивает их исследование. В этом исследовании мы описываем подходы к выращиванию для сбора, выращивания и поддержания долиолетта гегенбаури.
Abstract
Гелатиновские зоопланктоны играют решающую роль в океанских экосистемах. Тем не менее, как правило, трудно исследовать их физиологии, роста, плодовитости и трофических взаимодействий в первую очередь из-за методологических проблем, в том числе способность к их культуре. Это особенно верно для долиолида, Долиолетта гегенбаури. D. gegenbauri обычно встречается в продуктивных субтропических континентальных системах шельфа во всем мире, часто при концентрациях цветения, способных потреблять большую часть суточной первичной продукции. В этом исследовании мы описываем подходы к выращиванию для сбора, выращивания и поддержания D. gegenbauri с целью проведения лабораторных исследований. D. gegenbauri и другие виды doliolid могут быть захвачены жить с помощью косо буксусированных конических 202 мкм сетки планктона сетей с дрейфующего судна. Культуры наиболее надежно устанавливаются, когда температура воды ниже 21 градусов по Цельсию и начинается с незрелых гонозооидов, созревания phorozooids, и большие медсестры. Культуры могут поддерживаться в округлых сосудах культуры на медленно вращающемся колесе планктона и поддерживаться на диете культивированных водорослей в естественной морской воде на протяжении многих поколений. В дополнение к способности устанавливать лабораторные культуры D. gegenbauri, мы демонстрируем, что состояние сбора, концентрация водорослей, температура и воздействие естественно обусловленной морской воды имеют решающее значение для культуры создание, рост, выживание и размножение D. gegenbauri.
Introduction
Зоопланктон приходится на крупнейших животных биомассы в океане, являются ключевыми компонентами в морских пищевых сетей, и играют важную роль в океане биогеохимических циклов1,2. Зоопланктон, хотя и состоит из огромного разнообразия организмов, можно сильно различать на две категории: желатиновые и нежелатинские с несколькими промежуточными таксонами3,4. По сравнению с нежелатиновым зоопланктоном, желатиновый зоопланктон особеннотрудно изучать из-за их сложной истории жизни 5, и их тонкие ткани легко повреждаются во время захвата и обработки. Gelatinous зоопланктона видов, поэтому, как известно, трудно культуры в лаборатории и в целом менее изучены по сравнению с не-желатиновых видов6.
Среди желатиновых групп зоопланктона, один обильные и экологического значения в мировом океане являются thaliaceans. Талицеаны являются классом пелагических туникатов, которые включают в себя заказы Салпида, Пиросомида, и Долиолида7. Долилида, которую в совокупности называют долиолидами, представляют собой небольшие бочкообразные пелагические организмы, которые могут достигать высокого изобилия в продуктивных неритических регионах субтропических океанов. Долиолиды являются одними из самых распространенных из всех групп зоопланктона4,8. В качестве подвесных фидеров, долиолиды собирают частицы пищи из столбцаводы, создавая фильтровальных токов и захватывая их на слизистых сетях 9. Таксономически, долиолиды классифицируются в phylum Urochordata10. Предки хордатов, и в дополнение к их экологической значимости в качестве ключевых компонентов морских пелагических систем, thaliaceans имеют значение для понимания истоков колониальной истории жизни10,11 и эволюции из хордатов5,7,10,12,13,14.
История жизни долиолидов сложна и вносит свой вклад в трудности в культивирования и поддержания их в течение их жизненного цикла. Обзор полиолид жизненного цикла и анатомии можно найти в Godeaux и др.15. Это долиолидный жизненный цикл, который включает в себя обязательное чередование между сексуальными и бесполыми этапами истории жизни, представлен на рисунке 1. Яйца и сперматозоиды производятся гермафродическими гонозооидами, единственным одиночным этапом жизненного цикла. Gonozooids релиз спермы в колонку воды и яйца внутренне оплодотворены и выпущены развиваться в личинки. Личинки люк и метаморфозы в oozooids, которые могут достигать 1-2 мм. Предполагая благоприятные условия окружающей среды и питания, ooooids стать ранними медсестрами в течение 1-2 дней при 20 градусах Цельсия и инициировать колониальные этапы жизненного цикла. Oozooids бесполым веществом производят почки на их вентральном толоне. Эти почки оставляют столоон и мигрируют в дорсаловый кадофор, где они выстраиваются в три парных ряда. Центральные двойные ряды становят phorozooids и внешние 2 двойных ряда будут trophozooids. Последние обеспечивают питанием как медсестры, так и phorozooids16,17. Трофозуиды снабжают медсестру питанием, так как она теряет все внутренние органы. По мере увеличения численности трофозуидов размер медсестры может достигать 15 мм в лаборатории. По мере того как phorozooids растут, они все больше и больше гладают добычу планктона и достигают й 1.5 мм в размере до быть выпущенным как индивидуалы17. Одна медсестра может выпустить 100 phorozooids в течение своей жизни18. После того, как phorozooids высвобождаются из кадофора, они продолжают расти и являются вторым колониальным этапом жизненного цикла. Как только они достигают 5 мм в размерах, каждый phorozooid развивается кластер gonozooids на их брюшной peduncle. Эти гонозуиды могут глотать частицы, когда они достигают 1 мм в длину. После того, как гонозовиды достигли от 2 до 3 мм в размерах, они высвобождаются из phorozooid и становятся единственной одиночной стадией жизненного цикла. Как только они достигают 6 мм в размерах, gonozooids становятся сексуально зрелыми17. Гонозуиды могут достигать 9 мм и больше в длину. Гонозооиды гермафродические, сперма высвобождается с перерывами, в то время как оплодотворение яйцеклеток происходит внутренне16,17. Когда размер гонозооида составляет 6 мм, он высвобождает до 6 оплодотворенных яйцеклеток. Успешная культивирование требует поддержки конкретных потребностей каждого из этих уникальных этапов истории жизни.
В связи с экологическим и эволюционным значением талицей, в том числе долиолидов, существует необходимость в методах выращивания для продвижения понимания уникальной биологии этого организма, физиологии, экологии и эволюционной истории19 . Долиолиды имеют значительные перспективы в качестве экспериментальных моделей организмов в биологии развития и функциональной геномики, потому что они прозрачны и, вероятно, оптимизированы геномы20,21. Однако отсутствие надежных методов культивирования препятствует их полезности в качестве лабораторных моделей. Хотя несколько лабораторий опубликовали результаты, основанные на культивированных долиолидах, к нашим знаниям подходы к выращиванию и подробные протоколы ранее не публиковались. Основываясь на многолетнем опыте, и проб и ошибок попыток культивирования, цель этого исследования заключается в обзоре опыта и обмена протоколами для сбора и выращивания долиодов, в частности, вид Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последние несколько десятилетий был создан потенциал в области культуры долиолидов, который использовался для поддержки научных исследований в нескольких областях. Экспериментальные исследования в наших лабораториях поддержали публикацию по крайней мере 15 научных исследований, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны многим людям, которые внесли накопленные знания в этот проект на протяжении многих лет, включая Г.-А. Паффенхефер и Д. Дейбель, которые первоначально разработали эти протоколы. М. Кёстер и Л. Ламколей также внесли значительный вклад в разработку этих процедур. Н.Б. Лопес-Фигероа и З.Е. Родригес-Сантьяго составили оценки изобилия долиолидов, приведенные в таблице 1. Это исследование было частично поддержано Национальным научным фондом США награды OCE 082599, 1031263 в MEF, совместные проекты OCE 1459293 и OCE 14595010 в MEF и DMG и, Национальное управление океанических и атмосферных наград NA16SEC4810007 DMG. Мы благодарны трудолюбивому и профессиональному экипажу R/V Savannah. Ли Энн DeLeo подготовил цифры, Чарльз И. Робертсон корректир рукописи и, Джеймс (Джимми) Уильямс изготовлены планктона колесо
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous?. American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean’s minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D., Bone, Q. . The biology of pelagic tunicates. , 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
