I denna studie, vi beskriver ett detaljerat protokoll för att inducera lever vesikulär steatos i differentierade HepaRG celler med fettsyra salt natriumoleat och använda metoder för detektion och kvantifiering av lipidackumulering, inklusive sammanhängande anti-Stokes Raman spridning (bilar) mikroskopi, cytofluorimetrisk analys, olja röd O färgning, och qPCR.
Leversteatos representerar en metabolisk dysfunktion som resulterar från en ansamling av triglycerid innehållande lipiddroppar i hepatocyter. Överdriven fettansamling leder till alkoholfria fettlever (NAFLD), som är potentiellt reversibel och kan utvecklas till alkoholfri steatohepatit (NASH) och så småningom cirros och Hepatocellulär cancer (HCC). De molekylära mekanismerna som förbinder lipidackumulering i hepatocyter med progressionen till NASH, irreversibel leverskada, fibros, cirros, och även HCC är fortfarande oklart. För detta ändamål har flera in vitro-och in vivo-modeller utvecklats för att belysa de patologiska processer som orsakar NAFLD. I den nuvarande studien, beskriver vi en cellulär modell för induktion av lever vesikulär steatos som består av DMSO-differentierade mänskliga levern HepaRG celler behandlade med fettsyra salt natriumoleat. Faktum natrium Oleate-behandlade HepaRG celler ackumuleras lipiddroppar i cytoplasman och visar typiska egenskaper hos steatos. Denna in vitro human modell utgör ett värdefullt alternativ till in vivo möss modeller samt till de primära humana hepatocyter. Vi presenterar också en jämförelse av flera metoder för kvantifiering och utvärdering av ansamling av fett i HepaRG celler, inklusive olja röd O färgning, cytofluorimetrisk Bodipy mätning, metabolisk gen uttrycks analys av qPCR, och sammanhängande anti-Stokes Raman spridning (bilar) mikroskopi. BILAR Imaging kombinerar Raman spektroskopi kemiska specificitet, en kemisk analysteknik välkänd i materialvetenskap tillämpningar, med fördelarna med hög hastighet, högupplösta icke-linjära optiska microscopies att möjliggöra exakt kvantifiering av lipidackumulering och lipiddynamik. Inrättandet av en effektiv in vitro-modell för induktion av vesikulär steatos, tillsammans med en noggrann metod för kvantifiering och karakterisering av lipidackumulering, kan leda till utveckling av tidig diagnostisering av NAFLD via identifiering av molekyl markörer och generering av nya behandlingsstrategier.
Leversteatos definieras som intrahepatisk fettansamling, inom triglyceridinnehållande lipiddroppar, med minst 5% av lever vikten. Långvarig nedsatt lipidlagring är en potentiellt reversibel process, emellertid, det kan leda till lever metabolisk dysfunktion, inflammation och avancerade former av alkoholfria fettlever (NAFLD), den dominerande orsaken till kronisk leversjukdom i många delar av världen1,2. NAFLD är en multifaktoriell sjukdom som kan utvecklas till den mer aggressiva alkoholhaltig steatohepatit (NASH), som i sin tur kan utvecklas till cirros och, i en liten andel av patienterna, till Hepatocellulär cancer (HCC)1,3. Ingen godkänd behandling finns för närvarande som en särskild behandling för NAFLD och kombinationen av kost och livsstilsförändringar förblir pelaren i NAFLD och NASH Management4,5,6.
De molekylära mekanismerna som leder till utvecklingen av leversteatos i patogenesen av NAFLD återstår fortfarande att belysa7. I detta sammanhang har musmodeller utvecklats för att studera progression av Human leversteatos. En myriad av olika modeller existerar, och var och en har sina fördelar och nackdelar, inklusive genetiska, näringsmässiga och kemiskt inducerade modeller som kombinerar olika metoder. Genetiskt modifierade (transgena eller knockout) möss utvecklar spontant leversjukdom. Emellertid, det bör noteras att dessa mutationer är mycket sällsynta hos människor och radering eller överuttryck av en enda gen (t. ex., OB/ob mus) kan inte efterlikna etiologin för den multifaktoriella mänskliga sjukdomen på molekylär nivå8,9. Likaså kan den sjukdom som förvärvas av möss efter diet eller farmakologisk manipulation inte efterlikna effekterna av mänsklig kost i samband med utvecklingen av NAFLD i man8. Djurmodeller har dock underlättat utvecklingen i förståelsen av NAFLD och detta tillvägagångssätt är för närvarande den mest använda strategin i laboratorieforskning. Ändå har replikation hos människor av resultat som erhållits i djurmodeller upprepade gånger misslyckats, vilket orsakar dålig översättning till kliniken10.
Därför, in vitro-modeller av NAFLD kan spela en grundläggande roll i att belysa de molekylära mekanismerna i NAFLD progression, och de utgör ett värdefullt verktyg för att avskärma ett stort antal föreningar. Primära cellkulturer, förevigade cellinjer och leverbiopsier har i stor utsträckning använts för forskningsändamål11. Primära humana hepatocyter liknar mycket humana kliniska tillstånd, men det finns ett begränsat antal givare, och primära cellkulturer uppvisar dålig reproducerbarhet på grund av cellernas variation. Dessa observationer, tillsammans med etiska och logistiska frågor, har resulterat i användning av humana primära hepatocyter är begränsad12. Sålunda, lever cellinjer utgör ett bekvämt alternativ, med flera viktiga fördelar jämfört med primärkulturen, som lever cellinjer växa stadigt, har en nästan obegränsad livslängd, och har en stabil fenotyp. Dessutom är cellinjer lättillgängliga och kultur förhållandena för levercellinjer är enklare än för primära hepatocyter och är standardiserade mellan olika laboratorier.
Här beskriver vi i detalj en in vitro-cellbaserad modell av levervesikulär steatos, representerad av leverdifferentierade HepaRG-celler behandlade med fettsyran natriumoleat. Den HepaRG cellinjer etablerades från en kvinnlig patient som drabbats av hepatit C-infektion och en Edmondson grad jag väl differentierade lever tumör14. Den HepaRG cellinjer är en mänsklig bipotent progenitorcellinjer som kan differentiera vid exponering för 2% dimetylsulfoxid (DMSO) mot två olika cell fenotyper: biliär-liknande och hepatocyte-liknande celler. Differentierade HepaRG celler (dHepaRG) dela vissa funktioner och egenskaper med vuxna hepatocyter och besitter förmågan att stabilt uttrycka leverspecifika gener såsom albumin, AldolaseB, cytokrom P450 2E1 (CYP2E1), och cytokrom P450 3A4 (CYP3A4)13 (steg 3). Behandling av dheparg celler med fettsyran salt natriumoleat (250 μm) för 5 dagar leda till generering av cytoplasmiska lipiddroppar, imitera effekterna av fettlever14,15,17,18 ( steg 4). Ansamling av lipiddroppar kan lätt upptäckas av olja röd O färgning (steg 5), en lysokrom fettlösliga färgämnen som fläckar neutrala triglycerider och lipider röd-orange. För att effektivt kvantifiera lipider i Fatty dHepaRG, här illustrerar vi cytofluorimetrisk analys efter färgning med 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetrametyl-4-Bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (steg 6), en lipofila fluorescerande sond som lokaliserar till intracellulära lipidkroppar och har använts för att märka lipiddroppar19. Dessutom, här visar vi hur man utvärderar steatos genom kvantitativ polymeras kedjereaktion (qPCR) (steg 7) genuttryck avreglering av flera metaboliska gener i dheparg celler. För att ytterligare karakterisera och kvantifiera ackumuleringen av lipiddroppar efter behandling med natriumoleat utförde vi sammanhängande anti-Stokes Raman spridning (Cars) mikroskopi (steg 8), en innovativ teknik som möjliggör visualisering och kvantifiering av lipiddroppar utan märkning20,21.
Detta protokoll beskriver hur man differentierar HepaRG-celler och hur man inducerar vesikulär steatos genom natriumoleatbehandling (figur 1A). I själva verket, jämfört med andra humana hepatocellulära carcinom (HCC) cellinjer, heparg cell linjen uppvisar egenskaper hos vuxna humana hepatocyter, som representerar ett värdefullt alternativ till ex vivo odlade primära humana hepatocyter13,14 ,<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar prof. Christian Trepo (INSERM U871, Lyon, Frankrike), som vänligt gav HepaRG celler. Vi är tacksamma mot Rita Appodia för administrativ hjälp. Detta arbete stöddes av MIUR-Ministero dell’ istruzione, dell’ Università e della ricerca (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) och Sapienza-universitetet i Rom (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).
Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
Insulin | SIGMA | I9278 | |
hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
Methanol | SIGMA | 179337 | |
Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
q-PCR oligo name | Sequence | ||
ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |