Inducerende og karakteriserende vesikulær steatosis i differentierede HepaRG-celler

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi en detaljeret protokol for at inducere levervesikulær steatose i differentierede heparg-celler med fedtsyresalt natriumoleat og anvende metoder til påvisning og kvantificering af lipid-akkumulering, herunder sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (biler) mikroskopi, cytofluorimetriske analyse, olie rød O farvning, og qPCR.

Abstract

Hepatisk steatose repræsenterer en metabolisk dysfunktion, der skyldes en ophobning af triglycerid-holdige lipid dråber i hepatocytter. Overdreven fedt ophobning fører til ikke-alkoholisk fedt leversygdom (NAFLD), som er potentielt reversibel og kan udvikle sig til ikke-alkoholisk steatohepatitis (Nash) og i sidste ende cirrhose og hepatocellulære karcinom (HCC). De molekylære mekanismer, der forbinder lipid ophobning i hepatocytter med progression til NASH, irreversibel leverskader, fibrose, cirrhose, og selv HCC stadig uklar. Til dette formål er flere in vitro-og in vivo-modeller blevet udviklet for at belyse de patologiske processer, der forårsager NAFLD. I nærværende undersøgelse beskriver vi en cellulær model for induktion af lever vesikulær steatose, der består af DMSO-differentierede humane hepatiske heparg-celler, som er behandlet med fedtsyre salt natriumoleat. Faktisk akkumulerer natriumoleatbehandlede HepaRG celler lipid dråber i cytoplasmaet og viser typiske funktioner af steatosis. Denne in vitro menneskelige model repræsenterer et værdifuldt alternativ til in vivo mus modeller samt til den primære humane hepatocytter. Vi præsenterer også en sammenligning af flere metoder til kvantificering og evaluering af fedt ophobning i HepaRG celler, herunder olie rød O farvning, cytofluorimetriske Bodipy måling, metabolisk genekspression analyse af qPCR, og sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (biler) mikroskopi. CARS Imaging kombinerer den kemiske specificitet af Raman spektroskopi, en kemisk analyseteknik velkendt i materialevidenskab applikationer, med fordelene ved høj hastighed, høj opløsning ikke-lineære optiske mikroskoper at give præcise kvantificering af lipid ophobning og lipid dråbe dynamik. Etableringen af en effektiv in vitro-model til induktion af vesikulær steatosis sammen med en nøjagtig metode til kvantificering og karakterisering af lipid-akkumulering kan føre til udvikling af tidlig stadie diagnose af NAFLD via identifikation af molekylære markører og til generering af nye behandlingsstrategier.

Introduction

Hepatisk steatose er defineret som intrahepatisk fedt ophobning, i triglycerid-holdige lipid dråber, på mindst 5% af leveren vægt. Langvarig hepatisk Lipid opbevaring er en potentielt reversibel proces, men, det kan føre til lever metabolisk dysfunktion, inflammation og avancerede former for ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD), den fremherskende årsag til kronisk leversygdom i mange dele af verden^1,2. NAFLD er en multifaktoriel sygdom, der kan udvikle sig til den mere aggressive ikke-alkoholiske steatohepatitis (Nash), som igen kan fremskridt til cirrhose og, i en lille procentdel af patienterne, til hepatocellulære karcinom (HCC)^1,3. Ingen godkendt behandling er i øjeblikket tilgængelig som en specifik behandling for NAFLD og kombinationen af kost og livsstils modifikationer forbliver søjlen i NAFLD og Nash Management^4,5,6.

De molekylære mekanismer, der fører til udvikling af hepatisk steatose i patogenesen af NAFLD stadig være belyst⁷. I denne sammenhæng er musemodeller blevet udviklet til at studere Human steatose sygdomsprogression. Der findes et utal af forskellige modeller, og hver enkelt har sine fordele og ulemper, herunder genetiske, ernæringsmæssige og kemisk inducerede modeller, der kombinerer forskellige tilgange. Genetisk modificerede (transgene eller knockout) mus udvikler spontant leversygdom. Det skal dog bemærkes, at disse mutationer er meget sjældne hos mennesker og sletning eller over-ekspression af et enkelt gen (f. eks OB/OB mus) kan ikke efterligne etiologien af den multifaktoriale menneskelige sygdom på molekyleniveau^8,9. Ligeledes, sygdommen erhvervet af mus efter kosten eller farmakologisk manipulation kan ikke efterligne virkningerne af menneskelige kost i forbindelse med udviklingen af NAFLD i man⁸. Dyremodeller har imidlertid fremmet udviklingen i forståelsen af NAFLD, og denne fremgangsmåde er i øjeblikket den hyppigst anvendte strategi inden for laboratorieforskning. Ikke desto mindre, replikation i mennesker af resultater opnået i dyremodeller har gentagne gange slået fejl, forårsager dårlig oversættelse til klinikken¹⁰.

Derfor kan in vitro-modeller af NAFLD spille en grundlæggende rolle i at belyse de molekylære mekanismer i NAFLD progression, og de repræsenterer et værdifuldt værktøj til at screene et stort antal forbindelser. Primære cellekulturer, udødeliggjort cellelinjer og leverbiopsier er blevet flittigt anvendt til forskningsformål¹¹. Primære humane hepatocytter ligner nøje humane kliniske tilstande, men der er et begrænset antal donorer, og primære cellekulturer viser dårlig reproducerbarhed på grund af variabiliteten af cellerne. Disse observationer har sammen med etiske og logistiske spørgsmål resulteret i en begrænset anvendelse af humane primære hepatocytter¹². Således, lever cellelinjer repræsenterer en bekvem alternativ, der har flere væsentlige fordele i forhold til primær kultur, som hepatiske cellelinjer vokse støt, har en næsten ubegrænset levetid, og har en stabil fænotype. Desuden er cellelinjer let tilgængelige, og dyrkningsbetingelserne for hepatiske cellelinjer er enklere end de primære hepatocytter og er standardiseret blandt forskellige laboratorier.

Her beskriver vi i detaljer en in vitro celle-baseret model af lever vesikulær steatosis, repræsenteret ved hepatisk differentierede HepaRG celler behandlet med fedtsyre natriumoleat. HepaRG celle linjen blev etableret fra en kvindelig patient ramt af hepatitis C infektion og en Edmondson grade jeg veldifferentieret lever tumor¹⁴. HepaRG celle linjen er en menneskelig bipotent stamcelle linje, der kan skelne ved udsættelse for 2% dimethylsulfoxid (DMSO) mod to forskellige celle fænotyper: biliær-lignende og hepatocyt-lignende celler. Differentierede HepaRG celler (dHepaRG) dele nogle funktioner og egenskaber med voksne hepatocytter og besidder evnen til stabilt at udtrykke lever-specifikke gener såsom albumin, AldolaseB, cytochrom P450 2E1 (CYP2E1), og cytochrom P450 3A4 (CYP3A4)¹³ (trin 3). Behandling af dheparg celler med fedtsyre salt natriumoleat (250 μM) i 5 dage føre til generering af cytoplasmiske lipid dråber, efterligne virkningerne af fede lever^14,15,17,18 ( trin 4). Ophobning af lipid dråber kan let påvises ved olie rød O farvning (trin 5), en lysokrom fedtopløseligt farvestof, der pletter neutrale triglycerider og lipiderne rød-orange. For effektivt at kvantificere lipiderne i fedt dHepaRG her illustrerer vi cytofluorimetrisk analyse efter farvning med 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3a, 4a-Diaza-s-indacen (Bodipy 505/515) (trin 6), en lipophisk fluorescerende sonde, der lokaliserer til intracellulære lipid organer og er blevet brugt til at mærke lipid dråber¹⁹. Desuden viser vi her, hvordan man evaluerer steatose ved kvantitativ polymerase kædereaktion (qPCR) (trin 7) genekspression deregulering af flere metaboliske gener i dheparg-celler. For yderligere at karakterisere og kvantificere ophobning af lipid dråber efter natriumoleat behandling, vi udførte sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (biler) mikroskopi (trin 8), en innovativ teknik, der muliggør visualisering og kvantificering af lipid dråber uden mærkning^20,21.

Protocol

1. forberedelse af kultur medier og reagenser Prolifererende medium: supplement William’s E medium med GlutaMAX, 10% føtal kvægserum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, 5 μg/mL insulin og 0,5 μM hydrocortison hemisuccinat. Differentiering medium: supplere William’s E medium med GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 5 μg/mL insulin, 50 μM hydrocortison hemisuccinat og 2% DMSO. Frysning medium: supplement prolifererende medium med 10% DMSO. Natriumoleat: opløses i 99% …

Representative Results

Denne protokol beskriver en effektiv metode til at fremkalde og karakterisere vesikulær steatose i DMSO-differentierede heparg-celler ved natriumoleatbehandling (figur 1A). Differentiering af HepaRG-celler.For effektivt at inducere differentiering skal prolifererende celler seedet med lav densitet (2,5 x 104 celler/cm2) i sprednings mediet. Når seedede ved lav densitet, cellerne opdele og erhverve en af…

Discussion

Denne protokol beskriver, hvordan heparg-celler differentieres, og hvordan man fremkalder vesikulær steatose ved behandling med natriumoleat (figur 1A). Sammenlignet med andre humane hepatocellulære karcinom (HCC) cellelinjer udstiller heparg celle linjen funktioner af voksne humane hepatocytter, der repræsenterer et værdifuldt alternativ til ex vivo-dyrkede primære humane hepatocytter^{13,14 ,}<sup cla…

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC