Induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans des cellules HepaRG différenciées

Summary

Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé pour induire la stéatose vésiculaire de foie dans les cellules différenciées d’HépaRG avec l’oleat sodium de sel d’acide gras et employons des méthodes pour la détection et la quantification de l’accumulation de lipide, y compris les anti-Stokes cohérents Microscopie de diffusion raman (CARS), analyse cytofluorimétrique, coloration rouge huile O et qPCR.

Abstract

La stéatose hépatique représente un dysfonctionnement métabolique qui résulte d’une accumulation de gouttelettes lipidiques contenant des triglycérides dans les hépatocytes. L’accumulation excessive de graisse mène à la maladie de foie gras non-alcoolique (NAFLD), qui est potentiellement réversible et peut évoluer en stéatohépatite non-alcoolique (NASH) et par la suite cirrhose et carcinome hépatocellulaire (HCC). Les mécanismes moléculaires liant l’accumulation de lipide dans les hépatocytes avec la progression à NASH, les dommages irréversibles de foie, la fibrose, la cirrhose, et même HCC restent toujours peu clairs. À cette fin, plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés pour élucider les processus pathologiques qui causent nAFLD. Dans la présente étude, nous décrivons un modèle cellulaire pour l’induction de la stéatose vésiculaire du foie qui se compose de cellules hepaRG hepatic humaines différenciées DMSO traitées avec l’oleat de sodium de sel d’acide gras. En effet, les cellules HepaRG traitées à l’oleat de sodium accumulent des gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et présentent des caractéristiques typiques de la stéatose. Ce modèle humain in vitro représente une alternative précieuse aux modèles de souris in vivo ainsi qu’aux hépatocytes humains primaires. Nous présentons également une comparaison de plusieurs méthodes pour la quantification et l’évaluation de l’accumulation de graisse dans les cellules de HepaRG, y compris la coloration rouge d’huile o, la mesure cytofluorimétrique de Bodipy, l’analyse métabolique d’expression de gène par qPCR, et l’anti-Stokes cohérent Microscopie de diffusion raman (CARS). L’imagerie CARS combine la spécificité chimique de la spectroscopie Raman, une technique d’analyse chimique bien connue dans les applications de la science des matériaux, avec les avantages de microscopies optiques non linéaires à haute vitesse et à haute résolution pour permettre quantification de l’accumulation de lipides et de la dynamique des gouttelettes lipidiques. La mise en place d’un modèle in vitro efficace pour l’induction de la stéatose vésiculaire, ainsi qu’une méthode précise pour la quantification et la caractérisation de l’accumulation de lipides, pourrait conduire au développement d’un diagnostic précoce de NAFLD via le l’identification des marqueurs moléculaires et à la génération de nouvelles stratégies de traitement.

Introduction

La stéatose hépatique est définie comme une accumulation de graisse intrahépatique, dans des gouttelettes lipidiques contenant des triglycérides, d’au moins 5 % du poids du foie. Le stockage hépatique prolongé de lipide est un processus potentiellement réversible, cependant, il peut mener au dysfonctionnement métabolique de foie, à l’inflammation et aux formes avancées de la maladie hépatique non alcoolique (NAFLD), la cause prédominante de la maladie chronique de foie dans beaucoup de parties de le monde^1,2. NAFLD est une maladie multifactorielle qui peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique plus agressive (NASH), qui à son tour peut progresser vers la cirrhose et, dans un petit pourcentage de patients, au carcinome hépatocellulaire (HCC)^1,3. Aucun traitement approuvé n’est actuellement disponible comme traitement spécifique pour NAFLD et la combinaison des modifications de régime et de mode de vie reste le pilier de la gestion de NAFLD et de NASH^4,5,6.

Les mécanismes moléculaires menant au développement de la stéatose hépatique dans la pathogénie de NAFLD restent à élucider⁷. Dans ce contexte, des modèles murins ont été développés pour étudier la progression de la maladie de stéatose humaine. Une myriade de modèles différents existe, et chacun a ses avantages et ses inconvénients, y compris les modèles génétiques, nutritionnels et induits chimiquement combinant des approches différentes. Les souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out) développent spontanément une maladie du foie. Cependant, il convient de noter que ces mutations sont très rares chez l’homme et la suppression ou la surexpression d’un seul gène (par exemple, ob / ob souris) ne peut pas imiter l’étiologie de la maladie humaine multifactorielle au niveau moléculaire^8,9. De même, la maladie acquise par les souris après manipulation diététique ou pharmacologique ne peutpas imiter les effets des régimes humains liés au développement de NAFLD dans l’homme 8. Les modèles animaux ont toutefois facilité l’évolution de la compréhension de la NAFLD et cette approche est actuellement la stratégie la plus utilisée dans la recherche en laboratoire. Néanmoins, la réplication chez l’homme des résultats obtenus dans les modèles animaux a échoué à plusieurs reprises, provoquant une mauvaise traduction dans la clinique¹⁰.

Par conséquent, les modèles in vitro de NAFLD peuvent jouer un rôle fondamental en élucidant les mécanismes moléculaires de la progression de NAFLD, et ils représentent un outil valable pour examiner un grand nombre de composés. Les cultures cellulaires primaires, les lignées cellulaires immortalisées et les biopsies hépatiques ont été largement utilisées à des fins de recherche¹¹. Les hépatocytes humains primaires ressemblent étroitement aux conditions cliniques humaines, mais il y a un nombre limité de donneurs, et les cultures primaires de cellules montrent la reproductibilité pauvre due à la variabilité des cellules. Ces observations, ainsi que des questions éthiques et logistiques, ont entraîné l’utilisation d’hépatocytes primaires humains étant limité¹². Ainsi, les lignées cellulaires hépatiques représentent une alternative pratique, ayant plusieurs avantages essentiels sur la culture primaire, que les lignées cellulaires hépatiques se développent régulièrement, ont une durée de vie presque illimitée, et ont un phénotype stable. En outre, les lignées cellulaires sont facilement accessibles et les conditions de culture des lignées cellulaires hépatiques sont plus simples que celles des hépatocytes primaires et sont normalisées entre les différents laboratoires.

Ici, nous décrivons en détail un modèle cellulaire in vitro de stéatose vésiculaire de foie, représenté par les cellules hepaRG différenciées hépatiques traitées avec l’oleat de sodium d’acide gras. La ligne cellulaire de HepaRG a été établie à partir d’un patient féminin affecté par l’infection d’hépatite C et d’une tumeur bien différenciée de foie de catégorie I d’Edmondson^14. La lignée cellulaire HepaRG est une lignée cellulaire bipotente humaine capable de se différencier lors de l’exposition au sulfoxure de diméthyle (DMSO) de 2 % vers deux phénotypes cellulaires différents : les cellules biliaires et hépatocytes. Les cellules HepaRG différenciées (dHepaRG) partagent certaines caractéristiques et propriétés avec les hépatocytes adultes et possèdent la capacité d’exprimer de façon stable des gènes spécifiques au foie tels que l’albumine, l’aldolaseB, le Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) et cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)¹³ (étape 3). Le traitement des cellules dHepaRG avec l’oleat de sodium de sel de sel d’acide gras (250 M) pendant 5 jours mènent à la génération des gouttelettes cytoplasmiques de lipide, imitant les effets du foie gras^14,15,17,18 ( étape 4). L’accumulation de gouttelettes lipidiques peut être facilement détectée par la coloration Oil Red O (étape 5), un colorant liposoluble lysochrome qui tache les triglycérides neutres et les lipides rouge-orange. Pour quantifier efficacement les lipides dans le dHepaRG gras, nous illustrons ici l’analyse cytofluorimétrique après coloration avec 4,4-difluoro-1,3,5,5,7-tétramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (étape 6), une sonde fluorescente lipophile qui localise aux corps lipidiques intracellulaires et a été utilisé pour étiqueter les gouttelettes lipidiques¹⁹. En outre, ici nous montrons comment évaluer la stéatose par réaction quantitative en chaîne de polymérase (qPCR) (étape 7) déréglementation d’expression de gène de plusieurs gènes métaboliques dans les cellules dHepaRG. Pour caractériser et quantifier davantage l’accumulation de gouttelettes lipidiques après le traitement à l’avoine de sodium, nous avons effectué une microscopie cohérente de diffusion anti-Stokes Raman (CARS) (étape 8), une technique innovante qui permet la visualisation et la quantification de gouttelettes lipidiques sans étiquetage^20,21.

Protocol

1. Préparation des médias culturels et des réactifs Moyen proliférant : supplément du milieu E de William avec glutaMAX, 10% sérum bovin foetal (FBS), 1% pénicilline/streptomycine, insuline de 5 g/mL et 0.5 ‘M d’hemisuccinate d’hydrocortisone. Moyen de différenciation : supplément du milieu E de William avec GlutaMAX, 10% FBS, 1% pénicilline/streptomycine, insuline de 5 g/mL, 50 ‘M d’hémicine hydrocortisone et 2% d’hemisuccinate d’hydrocortisone et 2% de DMSO. Milieu de congélati…

Representative Results

Ce protocole décrit une méthode efficace pour induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans les cellules HepaRG différenciées d’IllSO par le traitement de l’oleatde de sodium (figure 1A). Différenciation des cellules HepaRG.Pour induire efficacement la différenciation, les cellules proliférantes doivent être ensemencées à faible densité (2,5 x 104 cellules/cm2) dans le milieu de proli…

Discussion

Ce protocole décrit comment différencier les cellules HepaRG et comment induire la stéatose vésiculaire par traitement à l’avoine de sodium (Figure 1A). En effet, par rapport à d’autres lignées cellulaires du carcinome hépatocellulaire humain (HCC), la lignée cellulaire HepaRG présente des caractéristiques d’hépatocytes humains adultes, représentant une alternative précieuse aux hépatocytes humains primaires cultivés ex vivo^13,</s…

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC