Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

Summary

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Induktion von Lebervesikulärsteatose in differenzierten HepaRG-Zellen mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat und verwenden Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung der Lipidakkumulation, einschließlich kohärenter Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie, zytofluorimetrische Analyse, Ölrot O-Färbung und qPCR.

Abstract

Hepatische Steatose stellt eine metabolische Dysfunktion dar, die aus einer Anhäufung von Triglycerid-haltigen Lipidtröpfchen in Hepatozyten resultiert. Übermäßige Fettansammlung führt zu einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die potenziell reversibel ist und sich zu alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) und schließlich zu Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC) entwickeln kann. Die molekularen Mechanismen, die die Fettakkumulation in Hepatozyten mit dem Fortschreiten zu NASH, irreversibleleber Leberschäden, Fibrose, Zirrhose und sogar HCC verbinden, sind noch unklar. Zu diesem Zweck wurden mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle entwickelt, um die pathologischen Prozesse aufzuklären, die NAFLD verursachen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein zelluläres Modell für die Induktion der vesikulären Steatose der Leber, das aus DMSO-differenzierten menschlichen Hepatic-HepaRG-Zellen besteht, die mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat behandelt werden. Tatsächlich akkumulieren Natriumoleat-behandelte HepaRG-Zellen Lipidtröpfchen im Zytoplasma und zeigen typische Merkmale der Steatose. Dieses in vitro humane Modell stellt eine wertvolle Alternative zu in vivo-Mäusemodellen sowie zu den primären menschlichen Hepatozyten dar. Wir präsentieren auch einen Vergleich mehrerer Methoden zur Quantifizierung und Bewertung der Fettansammlung in HepaRG-Zellen, einschließlich Oil Red O Färbung, zytofluorimetrische Rbodipy-Messung, metabolische Genexpressionsanalyse durch qPCR und kohärente Anti-Stokes Raman-Streumikroskopie (CARS). CARS Imaging kombiniert die chemische Spezifität der Raman-Spektroskopie, einer in materialwissenschaftlichen Anwendungen bekannten chemischen Analysetechnik, mit den Vorteilen von hochschnellen, hochauflösenden nichtlinearen optischen Mikrokopien, um präzise Quantifizierung der Lipidakkumulation und Lipidtröpfchendynamik. Die Erstellung eines effizienten In-vitro-Modells für die Induktion der vesikulären Steatose, zusammen mit einer genauen Methode zur Quantifizierung und Charakterisierung der Lipidakkumulation, könnte zur Entwicklung einer Frühstadiumdiagnose von NAFLD über die Identifizierung molekularer Marker und die Generierung neuer Behandlungsstrategien.

Introduction

Lebersteatose ist definiert als intrahepatische Fettansammlung, innerhalb triglyceridhaltiger Lipidtröpfchen, von mindestens 5% des Lebergewichts. Längere Leberlipidspeicherung ist ein potenziell reversibler Prozess, jedoch kann es zu Leberstoffwechselfunktionsstörungen, Entzündungen und fortgeschritteneformen Formen der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD), die vorherrschende Ursache der chronischen Lebererkrankung in vielen Teilen der die Welt^1,2. NAFLD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die sich zu der aggressiveren alkoholfreien Steatohepatitis (NASH) entwickeln kann, die wiederum zu Zirrhose und in einem kleinen Prozentsatz der Patienten zu einem hepatozellulären Karzinom (HCC)^1,3weiterführen kann. Derzeit gibt es keine zugelassene Therapie als spezifische Behandlung für NAFLD und die Kombination von Ernährungs- und Lebensstiländerungen bleibt die Säule des NAFLD- und NASH-Managements^4,5,6.

Die molekularen Mechanismen, die zur Entwicklung der Lebersteatose bei der Pathogenese von NAFLD führen, müssen noch aufgeklärt werden⁷. In diesem Zusammenhang wurden Mausmodelle entwickelt, um das Fortschreiten der humanen Steatose-Krankheit zu untersuchen. Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher Modelle, und jedes hat seine Vor- und Nachteile, einschließlich genetischer, ernährungsphysiologischer und chemisch induzierter Modelle, die verschiedene Ansätze kombinieren. Genetisch veränderte (transgene oder Knockout) Mäuse entwickeln spontan Lebererkrankungen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Mutationen beim Menschen sehr selten sind und die Deletion oder Überexpression eines einzelnen Gens (z. B. ob/ob mouse) die Ätiologie der multifaktoriellen menschlichen Krankheit auf molekularer Ebene^8,9nicht imitieren darf. Ebenso kann die Krankheit, die von Mäusen nach diätetische oder pharmakologische Manipulation erworben wird, nicht die Auswirkungen der menschlichen Ernährung imitieren, die mit der Entwicklung von NAFLD beim Menschen⁸verbunden ist. Tiermodelle haben jedoch Entwicklungen im Verständnis von NAFLD erleichtert, und dieser Ansatz ist derzeit die am häufigsten verwendete Strategie in der Laborforschung. Dennoch ist die Replikation der in Tiermodellen erzielten Ergebnisse beim Menschen wiederholt fehlgeschlagen, was zu einer schlechten Übersetzung in die Klinik¹⁰geführt hat.

Daher können In-vitro-Modelle von NAFLD eine grundlegende Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen der NAFLD-Progression spielen, und sie stellen ein wertvolles Werkzeug dar, um eine große Anzahl von Verbindungen zu untersuchen. Primäre Zellkulturen, verewigte Zelllinien und Leberbiopsien wurden ausgiebig für Forschungszwecke verwendet¹¹. Primäre menschliche Hepatozyten ähneln den klinischen Erkrankungen des Menschen, aber es gibt eine begrenzte Anzahl von Spendern, und primäre Zellkulturen zeigen aufgrund der Variabilität der Zellen eine schlechte Reproduzierbarkeit. Diese Beobachtungen, zusammen mit ethischen und logistischen Fragen, haben dazu geführt, dass die Verwendung von menschlichen primären Hepatozyten begrenzt wurde¹². So stellen Leberzelllinien eine bequeme Alternative dar, die mehrere wesentliche Vorteile gegenüber der Primärkultur hat, da Leberzelllinien stetig wachsen, eine nahezu unbegrenzte Lebensdauer haben und einen stabilen Phänotyp haben. Darüber hinaus sind Zelllinien leicht zugänglich und die Kulturbedingungen von Leberzelllinien sind einfacher als die von primären Hepatozyten und sind zwischen verschiedenen Laboratorien standardisiert.

Hier beschreiben wir detailliert ein in vitro zellbasiertes Modell der vesikulären Lebersteatose, dargestellt durch hepatische differenzierte HepaRG-Zellen, die mit dem Fettsäure-Natriumoleat behandelt werden. Die HepaRG-Zelllinie wurde von einer weiblichen Patientin, die von einer Hepatitis-C-Infektion betroffen ist, und einem Edmondson-Grad-I-Gut differenzierten Lebertumor¹⁴festgestellt. Die HepaRG-Zelllinie ist eine menschliche bipotente Vorläuferzelllinie, die in der Lage ist, bei Exposition gegenüber 2% Dimethylsulfoxid (DMSO) zu zwei verschiedenen Zellphänotypen zu differenzieren: Gallen- und Hepatozyten-ähnliche Zellen. Differenzierte HepaRG-Zellen (dHepaRG) teilen einige Merkmale und Eigenschaften mit erwachsenen Hepatozyten und besitzen die Fähigkeit, leberspezifische Gene wie Albumin, AldolaseB, Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) und Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) stabil auszudrücken¹³ (Schritt 3). Die Behandlung von dHepaRG-Zellen mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat (250 M) für 5 Tage führt zur Erzeugung von zytoplasmatischen Lipidtröpfchen, die die Auswirkungen der Fettleber^14,15,17,18 ( Schritt 4). Die Anhäufung von Lipidtröpfchen kann leicht durch Oil Red O Färbung (Schritt 5) erkannt werden, einem Lysochrom-Fett-löslichen Farbstoff, der neutrale Triglyceride und Lipide rot-orange färbt. Zur effizienten Quantifizierung von Lipiden in fetthaltigem dHepaRG illustrieren wir hier die zytofluorimetrische Analyse nach der Färbung mit 4,4-Difluor-1,3,5,7-Tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (Bodipy 505/515) (Schritt 6), einer lipophilen fluoreszierenden Sonde, die intrazellulären Lipidkörpern und wurde zur Kennzeichnung von Lipidtröpfchen¹⁹verwendet. Darüber hinaus zeigen wir hier, wie die Steatose durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) (Schritt 7) Genexpression Deregulierung mehrerer metabolischer Gene in dHepaRG-Zellen zu bewerten. Um die Ansammlung von Lipidtröpfchen nach der Natriumoleatbehandlung weiter zu charakterisieren und zu quantifizieren, führten wir eine kohärente Anti-Stokes Raman Streumikroskopie (CARS) (Schritt 8) durch, eine innovative Technik, die die Visualisierung und Quantifizierung von Lipidtröpfchen ohne Kennzeichnung^20,21.

Protocol

1. Herstellung von Kulturmedien und Reagenzien Vermehrungsmedium: Ergänzen Sie Williams E-Medium mit GlutaMAX, 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin, 5 g/ml Insulin und 0,5 m Hydrocortison-Hemisuccinat. Differenzierungsmedium: Ergänzung des E-Mediums von William mit GlutaMAX, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 g/ml Insulin, 50 M Hydrocortisonhemisuccinat und 2% DMSO. Gefriermedium: Ergänzung vermehrendes Medium mit 10% DMSO. Natriumoleat: in 99% Methanol …

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Induzieren und Charakterisierung der vesikulären Steatose in DMSO-differenzierten HepaRG-Zellen durch Natriumoleatbehandlung (Abbildung 1A). Differenzierung von HepaRG-Zellen.Um eine Differenzierung effizient zu induzieren, müssen vermehrende Zellen mit einer geringen Dichte (2,5 x 104 Zellen/cm2) im Proliferationsmedium ausgesät werden. Bei gerin…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie HepaRG-Zellen zu unterscheiden und wie vesikuläre Steatose durch Natriumoleatbehandlung induzieren (Abbildung 1A). Tatsächlich weist die HepaRG-Zelllinie im Vergleich zu anderen menschlichen Hepatozellulären Karzinom-Zelllinien Merkmale von erwachsenen menschlichen Hepatozyten auf, die eine wertvolle Alternative zu ex vivo kultivierten primären menschlichen Hepatozyten^{darstellen 13,14 <…}

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC