Summary

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Published: July 18, 2019
doi:

Summary

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato per indurre la steatosi vescicolare del fegato in cellule HepaRG differenziate con l’oleate di sodio acido grasso e impieghiamo metodi per il rilevamento e la quantificazione dell’accumulo di lipidi, compresi gli anti-Stokes coerenti Microscopia a dispersione Raman (CARS), analisi citofluorimetrica, colorazione Oo rosso olio e qPCR.

Abstract

La steatosi epatica rappresenta una disfunzione metabolica che deriva da un accumulo di goccioline di lipidi trigliceridi contenenti epatociti. L’eccessivo accumulo di grasso porta alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD), che è potenzialmente reversibile e può evolvere in steatoepatite analcolica (NASH) e infine cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC). I meccanismi molecolari che collegano l’accumulo di lipidi negli epatociti con la progressione alla NASH, danni epatici irreversibili, fibrosi, cirrosi, e anche HCC rimane ancora poco chiaro. A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli in vitro e in vivo per chiarire i processi patologici che causano NAFLD. Nel presente studio, descriviamo un modello cellulare per l’induzione della steatosi vescicolare del fegato che consiste di cellule Epatiche Epatiche Epatiche EpaRG epatiche differenziate d’AmSO trattate con l’acido grasso sale oleume di sodio. Infatti, le cellule HepaRG trattate con oleato di sodio accumulano goccioline lipidiche nel citoplasma e mostrano caratteristiche tipiche della steatosi. Questo modello umano in vitro rappresenta una valida alternativa ai modelli di topi in vivo e ai primari epediti umani. Presentiamo anche un confronto di diversi metodi per la quantificazione e la valutazione dell’accumulo di grasso nelle cellule HepaRG, tra cui la colorazione ORossa dell’olio, la misurazione citofluorimetrica del Bodipy, l’analisi metabolica dell’espressione genica da parte di qPCR e anti-Stokes coerenti microscopia a dispersione Raman (CARS). L’imaging CARS combina la specificità chimica della spettroscopia Raman, una tecnica di analisi chimica nota nelle applicazioni scientifiche dei materiali, con i vantaggi delle microscopie ottiche non lineari ad alta velocità e ad alta risoluzione per consentire quantificazione dell’accumulo di lipidi e della dinamica delle goccioline lipidiche. L’istituzione di un efficiente modello in vitro per l’induzione della steatosi vescicolare, insieme a un metodo accurato per la quantificazione e la caratterizzazione dell’accumulo di lipidi, potrebbe portare allo sviluppo di una diagnosi in fase iniziale di NAFLD tramite il l’identificazione dei marcatori molecolari e la generazione di nuove strategie di trattamento.

Introduction

La steatosi epatica è definita come accumulo di grasso intraepatico, all’interno di goccioline di lipidi contenenti trigliceridi, di almeno il 5% del peso del fegato. L’immagazzinamento prolungato di lipidi epatici è un processo potenzialmente reversibile, tuttavia, può portare a disfunzione metabolica del fegato epatico, infiammazione e forme avanzate di malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD), la causa predominante della malattia cronica del fegato in molte parti il mondo1,2. NAFLD è una malattia multifattoriale che può evolvere verso la steatoepatite non alcolica più aggressiva (NASH), che a sua volta può progredire in cirrosi e, in una piccola percentuale di pazienti, al carcinoma epatocellulare (HCC)1,3. Nessuna terapia approvata è attualmente disponibile come trattamento specifico per NAFLD e la combinazione di modifiche di dieta e stile di vita rimane il pilastro della gestione NAFLD e NASH4,5,6.

I meccanismi molecolari che portano allo sviluppo della steatosi epatica nella patogenesi del NAFLD rimangono ancora da chiarire7. In questo contesto, sono stati sviluppati modelli murini per studiare la progressione della malattia da steatosi umana. Esiste una miriade di modelli diversi, ognuno dei quali ha i suoi vantaggi e svantaggi, compresi i modelli genetici, nutrizionali e indotti chimicamente che combinano approcci diversi. I topi geneticamente modificati (transgenici o knockout) sviluppano spontaneamente malattie epatiche. Tuttavia, va notato che queste mutazioni sono molto rare nell’uomo e la delezione o sovraespressione di un singolo gene (ad esempio, topo ob/ob) non può imitare l’eziologia della malattia umana multifattoriale al livello molecolare8,9. Allo stesso modo, la malattia acquisita dai topi dopo la manipolazione dietetica o farmacologica non può imitare gli effetti delle diete umane associate allo sviluppo di NAFLD nell’uomo8. I modelli animali, tuttavia, hanno facilitato gli sviluppi nella comprensione del NAFLD e questo approccio è attualmente la strategia attualmente più utilizzata nella ricerca di laboratorio. Tuttavia, la replicazione negli esseri umani dei risultati ottenuti in modelli animali ha ripetutamente fallito, causando una cattiva traduzione nella clinica10.

Pertanto, i modelli in vitro di NAFLD possono svolgere un ruolo fondamentale nel chiarire i meccanismi molecolari della progressione NAFLD e rappresentano uno strumento prezioso per vagliare un gran numero di composti. Colture cellulari primarie, linee cellulari immortalate e biopsie epatiche sono state ampiamente utilizzate per scopi di ricerca11. Gli epatociti umani primari assomigliano molto alle condizioni cliniche umane, ma c’è un numero limitato di donatori, e le colture cellulari primarie mostrano scarsa riproducibilità a causa della variabilità delle cellule. Queste osservazioni, insieme a questioni etiche e logistiche, hanno portato all’uso di equali primari umani limitati12. Così, le linee cellulari epatiche rappresentano una comoda alternativa, avendo diversi vantaggi essenziali rispetto alla cultura primaria, poiché le linee cellulari epatiche crescono costantemente, hanno una durata di vita quasi illimitata e hanno un fenotipo stabile. Inoltre, le linee cellulari sono facilmente accessibili e le condizioni di coltura delle linee cellulari epatiche sono più semplici di quelle degli epediti primari e sono standardizzate tra diversi laboratori.

Qui, descriviamo in dettaglio un modello in vitro basato sulle cellule di steatosi epatica, rappresentato da cellule HepaRG differenziate epatiche trattate con l’oleato di sodio acido grasso. La linea cellulare HepaRG è stata stabilita da una paziente donna affetto da infezione da epatite C e da un tumore al fegato di Edmondson di grado I ben differenziato14. La linea cellulare HepaRG è una linea cellulare del progenitore biformicello umana in grado di differenziare l’esposizione al 2% di solforo dimetilo (DMSO) verso due diversi fenotipi cellulari: cellule biliari ed epatocitiche. Le cellule HepaRG differenziate (dHepaRG) condividono alcune caratteristiche e proprietà con gli epatociti adulti e possiedono la capacità di esprimere stabilmente geni specifici del fegato come Albumin, AldolaseB, Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) e Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)13 (passaggio 3). Il trattamento delle cellule dHepaRG con l’acido grasso sale sodio oleate (250 m) per 5 giorni porta alla generazione di goccioline lipidici citoplasmiche, imitando gli effetti del fegato grasso14,15,17,18 ( al punto 4). L’accumulo di goccioline lipidiche può essere facilmente rilevato dalla colorazione Oil Red O (fase 5), un colorante liposocroso solubile che macchia trigliceridi neutri e lipidi rosso-arancione. Per quantificare in modo efficiente i lipidi nel dHepaRG grasso, qui illustriamo l’analisi citofluorimetrica dopo la colorazione con 4,4-difluoro-1,3,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (passaggio 6), un lipofilificante locale ai corpi lipidici intracellulari ed è stato utilizzato per etichettare le goccioline di lipidi19. Inoltre, qui mostriamo come valutare la steatosi mediante reazione quantitativa della catena di polimerasi (qPCR) (passaggio 7) la deregolazione dell’espressione genica di diversi geni metabolici nelle cellule dHepaRG. Per caratterizzare ulteriormente e quantificare l’accumulo di goccioline di lipidi dopo il trattamento dell’oleate di sodio, abbiamo eseguito una microscopia coerente anti-Stokes Raman scattering (CARS) (fase 8), una tecnica innovativa che consente la visualizzazione e la quantificazione goccioline lipidiche senza etichettare20,21.

Protocol

1. Preparazione dei mezzi di coltura e dei reagenti Mezzo proliferante: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina e 0,5M di idrocortisone emisuccinato. Mezzi di differenziazione: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina, 50 emisuccinato idrocortisone M e 2% DMSO. Mezzo di congelamento: integrare il mezzo proliferante con 10% DMSO. …

Representative Results

Questo protocollo descrive un metodo efficace per indurre e caratterizzare la steatosi vescicolare nelle cellule HepaRG differenziate DMSO mediante trattamento di oleate di sodio (Figura 1A). Differenziazione delle cellule HepaRG.Per indurre in modo efficiente la differenziazione, le cellule proliferanti devono essere semitate ad una bassa densità (2,5 x 104 cellule/cm2) nel mezzo di proliferazione. Quan…

Discussion

Questo protocollo descrive come differenziare le cellule HepaRG e come indurre la steatosi vescicolare mediante trattamento con oleate di sodio (Figura 1A). Infatti, rispetto ad altre linee cellulari umane del carcinoma epatocellulare (HCC), la linea cellulare HepaRG presenta caratteristiche di epatociti umani adulti, che rappresentano una valida alternativa agli epaticiti umani primari coltivati espansioni13,14 <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il prof. Siamo grati a Rita Appodia per l’assistenza amministrativa. Questo lavoro è stato sostenuto da MIUR- Profession del’ dell’università e della ricerca (FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC) e Sapienza University of Rome (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II  GE Healthcare SH30066
William’s E medium with GlutaMAX  Thermofisher 32551087
Penicillin/streptomycin  SIGMA P4333
Insulin  SIGMA I9278
hydrocortisone hemisuccinate SIGMA H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide SIGMA D2438   
Sodium Oleate SIGMA O7501 
Methanol SIGMA 179337
Isopropanol SIGMA 278475
BODIPY 505/515 Thermofisher D3921
PBS Thermofisher 14190-250
Formaldehyde solution SIGMA 252549
RNAse free DNAseI Promega M198A 
Glass-bottomed dishes Willco Wells GWST-5040
Oil Red solution SIGMA O625
CellTiter 96 AQueous One Solution Promega  G3582
q-PCR oligo name Sequence
ACACB FOR CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR GCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REV TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV TTGGCAAATGCTTTCGCTC

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Di Cocco, S., Belloni, L., Nunn, A. D., Salerno, D., Piconese, S., Levrero, M., Pediconi, N. Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells. J. Vis. Exp. (149), e59843, doi:10.3791/59843 (2019).

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