本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸を用いた分化HepaRG細胞における肝小胞性脂肪症を誘導するための詳細なプロトコルを説明し、一貫性のある抗ストークスを含む脂質蓄積の検出と定量のための方法を採用する。ラマン散乱(CARS)顕微鏡、細胞フルオロメトリクス分析、オイルレッドO染色、およびqPCR。
肝脂肪症は、肝細胞におけるトリグリセリド含有脂脂脂小滴の蓄積から生じた代謝機能障害を表す。過剰な脂肪の蓄積は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)につながり、潜在的に可逆的であり、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、最終的には肝硬変および肝細胞癌(HCC)に進化する可能性がある。肝細胞の脂質蓄積とNASHへの進行、不可逆的な肝臓損傷、線維症、肝硬変、さらにはHCCを結びつける分子機構は依然として不明である。この目的のために、いくつかのインビトロおよびインビボモデルは、NAFLDを引き起こす病理学的プロセスを解明するために開発された。本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸で処理したDMSO分化ヒト肝肝肝細胞細胞からなる肝小胞性脂肪症の誘導に関する細胞モデルについて述べた。実際、オレイン酸ナトリウム処理HepaRG細胞は細胞質中の脂質液滴を蓄積し、脂肪症の典型的な特徴を示す。このインビトロヒトモデルは、生体内マウスモデルならびに一次ヒト肝細胞に対する貴重な代替手段を表す。また、オイルレッドO染色、細胞フルオロメトリックボディピー測定、qPCRによる代謝遺伝子発現解析、コヒーレントアンチストークなど、HepaRG細胞における脂肪蓄積の定量と評価のためのいくつかの方法の比較も提示します。ラマン散乱(CARS)顕微鏡。CARSイメージングは、材料科学アプリケーションでよく知られている化学分析技術であるラマン分光法の化学的特異性と、高速かつ高解像度の非線形光学顕微鏡の利点を組み合わせることで、正確な精度を可能にします。脂質蓄積および脂質液滴ダイナミクスの定量化。小胞性脂肪症の誘導のための効率的なインビトロモデルの確立は、脂質蓄積の定量化および特性評価のための正確な方法と共に、NAFLDの早期診断の開発につながる可能性がある。分子マーカーの同定、および新しい治療戦略の生成に。
肝脂肪症は、肝臓体重の少なくとも5%のトリグリセリド含有脂脂脂滴内の肝内脂肪蓄積として定義される。長期の肝脂質貯蔵は、潜在的に可逆的なプロセスであるが、それは肝臓代謝機能障害、炎症および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の高度な形態、多くの部分で慢性肝疾患の主な原因を引き起こす可能性がある世界1、2.NAFLDは、より積極的な非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進化する多因子性疾患であり、肝硬変に進行し、患者のごく一部では肝細胞癌(HCC)1、3に進行する可能性がある。NAFLDの特定の治療法として承認された治療法は現在利用でき、食事とライフスタイルの変更の組み合わせは、NAFLDおよびNASH管理4、5、6の柱のままです。
NAFLDの病因における肝性テアトーシスの発症につながる分子機構は、依然として解明されるべきである7.この文脈において、ヒトのステアトーシス病の進行を研究するためにマウスモデルが開発された。無数の異なるモデルが存在し、それぞれが異なるアプローチを組み合わせた遺伝的、栄養的および化学的に誘導されたモデルを含む、その長所と短所を持っています。遺伝子組み換え(トランスジェニックまたはノックアウト)マウスは、自発的に肝疾患を発症する。しかしながら、これらの変異はヒトでは非常にまれであり、単一遺伝子の欠失または過剰発現(例えば、ob/obマウス)は、分子レベル8、9における多因子ヒト疾患の病因を模倣しないかもしれないことに留意されたい。同様に、食事または薬理学的操作後にマウスによって獲得された疾患は、ヒト8におけるNAFLDの発症に関連するヒト食の影響を模倣しないかもしれない。しかし、動物モデルは、NAFLDの理解の開発を容易にしており、このアプローチは現在、実験室研究で最も頻繁に使用される戦略です。それにもかかわらず、動物モデルで得られた結果のヒトにおける複製は繰り返し失敗し、診療所10への翻訳が不十分である。
従って、NAFLDのインビトロモデルは、NAFLD進行の分子機構を解明する上で基本的な役割を果たし、多数の化合物をスクリーニングする貴重なツールを表す。一次細胞培養、不死細胞株および肝生検は、研究目的11のために広く使用されている。原発性ヒト肝細胞はヒトの臨床状態によく似ていますが、ドナーの数は限られており、一次細胞培養は細胞の変動性に起因する再現性が低い。これらの観察は、倫理的およびロジスティックな問題と共に、ヒト原発性肝細胞の使用が12に制限される結果となった。したがって、肝細胞株は、肝細胞株が着実に成長し、ほぼ無制限の寿命を有し、安定した表現型を有するので、一次培養に対するいくつかの本質的な利点を有する便利な代替手段を表す。さらに、細胞株は容易にアクセス可能であり、肝細胞株の培養条件は原発肝細胞の培養条件よりも単純であり、異なる実験室間で標準化されている。
ここでは、脂肪酸オレイン酸オレイン酸で処理した肝分化HepaRG細胞に代表される肝小胞性脂肪症のインビトロ細胞ベースモデルを詳細に説明する。HepaRG細胞株は、C型肝炎感染の影響を受けた女性患者およびエドモンドソングレードIよく分化した肝腫瘍14から確立された。HepaRG細胞株は、2%ジメチルスルホキシド(DMSO)に曝露した際に、胆汁様および肝細胞様細胞の2つの異なる細胞型に対して分化することができるヒトの二分性前駆細胞株である。分化HepaRG細胞(dHepaRG)は、成人肝細胞といくつかの特徴と特性を共有し、アルブミン、アルドラセB、シトクロムP450 2E1(CYP2E1)、およびシトクロムP450 3A4(CYP3A4)13などの肝臓特異的遺伝子を安定的に発現する能力を有する。(ステップ 3)を使用します。脂肪酸塩オレイン酸ナトリウム(250μM)を用いたdHepaRG細胞の治療は、細胞質脂質液滴の生成につながり、脂肪肝14、15、17、18()ステップ 4)。脂質液滴の蓄積は、オイルレッドO染色(ステップ5)、中性トリグリセリドおよび脂質赤オレンジを染色するリソクロム脂肪溶解色素によって容易に検出することができる。脂肪dHepaRGの脂質を効率的に定量するために、ここでは4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a-3a-3a-4a-diaza-s-インダシン(Bodipy 505/515)(ステップ6)で染色した後の細胞フルオロ分析を例示します。細胞内脂質体に、脂質液滴19を標識するために使用されている。また、ここでは、dHepaRG細胞における複数の代謝遺伝子の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)(ステップ7)によるテアトーシスの評価方法を示す。オレイン酸ナトリウム処理後の脂質液滴の蓄積をさらに特徴付け、定量化するために、一貫性のあるアンチストークス・ラマン散乱(CARS)顕微鏡検査(ステップ8)を行い、視覚化と定量化を可能にする革新的な技術を行いました。20、21を標識せずに脂質液滴。
このプロトコルは、HepaRG細胞を区別する方法と、オレイン酸ナトリウム処理による小胞性脂肪症を誘導する方法について説明する(図1A)。実際、他のヒト肝細胞癌(HCC)細胞株と比較して、HepaRG細胞株は成人ヒト肝細胞の特徴を示し、一次ヒト肝細胞を培養したex vivoに代わる貴重な代替手段を表す13,14 <sup clas…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、HepaRG細胞を親切に提供してくれたクリスチャン・トレポ教授(INSERM U871、フランス、リヨン)に感謝します。私たちは、行政支援のためにリタ・アポディアに感謝しています。この研究は、MIUR-大臣デル・イストルツィオーネ、デルユニバーシタ・エ・デッラ・ライスカ(FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC)、ローマのサピエンツァ大学(プロト)によってサポートされました。C26A13T8PS;Prot。C26A142MCH;Prot。C26A15LSXL)。
Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
Insulin | SIGMA | I9278 | |
hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
Methanol | SIGMA | 179337 | |
Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
q-PCR oligo name | Sequence | ||
ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |