I denne studien, beskriver vi en detaljert protokoll for inducing leveren flytande steatosis i differensiert HepaRG celler med fettsyrer salt natrium oleat og ansette metoder for påvisning og kvantifisering av lipid akkumulering, inkludert sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi, cytofluorimetric analyse, olje rød O farging, og qPCR.
Hepatic steatosis representerer en metabolsk dysfunksjon som resulterer fra en opphopning av triglyserider-inneholdende lipid dråper i hepatocytter. Overdreven fett opphopning fører til alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD), som er potensielt reversibel og kan utvikle seg til alkoholfrie steatohepatitis (NASH) og til slutt skrumplever og leverkreft (HCC). Den molekylære mekanismer knytte lipid akkumulering i hepatocytter med progresjon til NASH, irreversible leverskader, fibrose, skrumplever, og selv HCC fortsatt uklart. For dette formål har flere in vitro-og in vivo-modeller blitt utviklet for å belyse de patologiske prosessene som forårsaker NAFLD. I denne studien, beskriver vi en cellulær modell for induksjon av leveren flytande steatosis som består av DMSO-differensiert menneskelig hepatic HepaRG celler behandlet med fettsyrer salt natrium oleat. Faktisk, natrium oleat-behandlet HepaRG celler akkumuleres lipid dråper i cytoplasma og viser typiske trekk ved steatosis. Den menneskelige modellen in vitro representerer et verdifullt alternativ til in vivo mus modeller, så vel som til den primære menneskelige hepatocytter. Vi presenterer også en sammenligning av flere metoder for kvantifisering og evaluering av fett opphopning i HepaRG celler, inkludert olje rød O farging, cytofluorimetric Bodipy måling, metabolsk genuttrykk analyse av qPCR, og sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi. CARS Imaging kombinerer kjemiske spesifisitet av Raman spektroskopi, en kjemisk analyse teknikk velkjent i materialer vitenskap applikasjoner, med fordelene av høy hastighet, høy oppløsning ikke-lineære optiske microscopies å tillate presis kvantifisering av lipid akkumulering og lipid dråpe dynamikk. Etableringen av en effektiv in vitro modell for induksjon av flytande steatosis, sammen med en nøyaktig metode for kvantifisering og karakterisering av lipid akkumulering, kan føre til utvikling av tidlig fase diagnostisering av NAFLD via identifisering av molekylære markører, og til generering av nye behandlings strategier.
Hepatic steatosis er definert som intrahepatic fett akkumulering, innen triglyserider inneholder lipid dråper, av minst 5% av leveren vekt. Langvarig hepatic lipid lagring er en potensielt reversibel prosess, men, det kan føre til leveren metabolske dysfunksjon, betennelser og avanserte former for alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD), den dominerende årsaken til kronisk leversykdom i mange deler av i verden1,2. NAFLD er en multifaktoriell sykdom som kan utvikle seg til de mer aggressive alkoholfrie steatohepatitis (Nash), som igjen kan utvikle seg til skrumplever og, i en liten prosentandel av pasientene, til leverkreft (HCC)1,3. Ingen godkjent terapi er for tiden tilgjengelig som en spesifikk behandling for NAFLD og kombinasjonen av kosthold og livsstil modifikasjoner forblir søyle av NAFLD og Nash Management4,5,6.
De molekylære mekanismene som førte til utviklingen av hepatic steatosis i patogenesen av NAFLD fortsatt å være belyst7. I denne sammenhengen har musemodeller blitt utviklet for å studere menneskelig steatosis sykdomsprogresjon. En myriade av ulike modeller finnes, og hver og en har sine fordeler og ulemper, inkludert genetiske, ernæringsmessige og kjemisk indusert modeller kombinere ulike tilnærminger. Genmodifiserte (transgene eller knockout) mus spontant utvikle leversykdom. Imidlertid bør det bemerkes at disse mutasjoner er svært sjeldne hos mennesker og sletting eller over-uttrykk for et enkelt gen (f. eks OB/OB mus) kan ikke etterligne etiologi av multifaktoriell menneskelige sykdom på molekylær nivå8,9. Likeledes kan sykdommen ervervet av mus etter kosttilskudd eller farmakologisk manipulasjon ikke etterligne virkningene av menneskelige dietter knyttet til utvikling av NAFLD i mann8. Animal modeller har imidlertid tilrettelagt utviklingen i forståelsen av NAFLD og denne tilnærmingen er i dag den mest brukte strategien i laboratoriet forskning. Likevel har replikering i mennesker av resultater som oppnås i dyremodeller gjentatte ganger mislyktes, forårsaker dårlig oversettelse til klinikken10.
Derfor, in vitro modeller av NAFLD kan spille en fundamental rolle i elucidating den molekylære mekanismer av NAFLD progresjon, og de representerer et verdifullt verktøy for å skjermen et stort antall forbindelser. Primær cellekulturer, udødeliggjort cellelinjer og lever biopsier har blitt mye brukt til forskningsformål11. Primær menneskelig hepatocytter ligner nøye menneskelige kliniske forhold, men det er et begrenset antall givere, og primær cellekulturer viser dårlig reproduserbarhet på grunn av variasjon i cellene. Disse observasjonene, sammen med etiske og logistiske spørsmål, har resultert i bruk av menneskets primære hepatocytter er begrenset12. Dermed representerer hepatic cellelinjer et praktisk alternativ, har flere viktige fordeler fremfor primær kultur, som hepatic cellelinjer vokse jevnt, har en nesten ubegrenset levetid, og har en stabil fenotype. Videre er cellelinjer lett tilgjengelige og kultur betingelsene for hepatic cellelinjer er enklere enn de primære hepatocytter og er standardisert blant ulike laboratorier.
Her beskriver vi i detalj en in vitro celle-basert modell av leveren flytande steatosis, representert ved hepatic differensiert HepaRG celler behandlet med fettsyrer natrium oleat. Den HepaRG cellelinjen ble etablert fra en kvinnelig pasient rammet av hepatitt C-smitte og en Edmondson karakter jeg godt differensiert leveren svulst14. Den HepaRG cellelinjen er en menneskelig bipotent Stamcelle linje i stand til å skille ved eksponering til 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) mot to forskjellige celle fenotyper: galle-lignende og hepatocytter-lignende celler. Differensiert HepaRG celler (dHepaRG) dele noen funksjoner og egenskaper med voksen hepatocytter og har evnen til å stabilt uttrykke lever-spesifikke gener som albumin, AldolaseB, Cytokrom P450 2E1 (CYP2E1), og Cytokrom P450 3A4 (CYP3A4)13 (trinn 3). Behandling av dHepaRG celler med fettsyrer salt natrium oleat (250 μM) i 5 dager føre til generering av cytoplasmatiske lipid dråper, etterligne effekten av fettlever14,15,17,18 ( Trinn 4). Opphopning av lipid dråper kan lett oppdages av Oil Red O farging (trinn 5), en lysochrome fettløselige fargestoff som flekker nøytrale triglyserider og lipider rød-oransje. For effektivt å kvantifisere lipider i fatty dHepaRG, her illustrerer vi cytofluorimetric analyse etter farging med 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (trinn 6), en lipofile fluorescerende sonde som lokaliseres å intracellulære lipid kropper og har blitt brukt til å merke lipid dråper19. Videre viser vi hvordan man evaluerer steatosis ved kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (qPCR) (trinn 7) genuttrykk dereguleringen av flere metabolske gener i dHepaRG celler. For ytterligere å karakterisere og kvantifisere akkumulering av lipid dråper etter natrium oleat behandling, utførte vi sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi (trinn 8), en innovativ teknikk som gjør det mulig visualisering og kvantifisering av lipid dråper uten merking20,21.
Denne protokollen beskriver hvordan å differensiere HepaRG celler og hvordan å indusere flytande steatosis ved natrium oleat behandling (figur 1A). Faktisk, sammenlignet med andre menneskelige leverkreft (HCC) cellelinjer, HepaRG cellelinjen utstillinger funksjoner av voksne menneskelige hepatocytter, som representerer et verdifullt alternativ til ex vivo dyrket primære menneskelige hepatocytter13,14 ,…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Christian trepo (INSERM U871, Lyon, Frankrike), som ber forutsatt HepaRG celler. Vi er takknemlige til Rita Appodia for administrativ hjelp. Dette arbeidet ble støttet av MIUR-Ministero dell’istruzione, dell’università e della ricerca (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) og Sapienza-Universitetet i Roma (beskytte. C26A13T8PS; Beskytte. C26A142MCH; Beskytte. C26A15LSXL).
Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
Insulin | SIGMA | I9278 | |
hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
Methanol | SIGMA | 179337 | |
Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
q-PCR oligo name | Sequence | ||
ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
b-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
b-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |