Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

Summary

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo detalhado para induzir o esteatose vesicular do fígado em pilhas diferenciadas de HepaRG com o oleato do sódio do sal do ácido gordo e empregamos métodos para a deteção e a quantificação da acumulação do lipido, incluindo anti-Stokes coerente Microscopia do espalhamento de Raman (carros), análise cytofluorimetric, mancha vermelha O do óleo, e qPCR.

Abstract

A esteatose hepática representa uma disfunção metabólica que resulta de um acúmulo de gotas lipídicas contendo triglicerídeos em hepatócitos. O acúmulo excessivo de gordura leva à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que é potencialmente reversível e pode evoluir para esteatohepatite não alcoólica (NASH) e, eventualmente, cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC). Os mecanismos moleculares que ligam a acumulação lipídica em hepatócitos com a progressão para NASH, dano hepático irreversível, fibrose, cirrose e até mesmo HCC ainda permanecem obscuros. Para isso, vários modelos in vitro e in vivo foram desenvolvidos para elucidar os processos patológicos que causam a DHGNA. No presente estudo, descrevemos um modelo celular para a indução de esteatose vesicular hepática que consiste em células de HepaRG hepáticas humanas diferenciadas por DMSO tratadas com o oleato de sódio de sal de ácidos graxos. De fato, as células HepaRG tratadas com oleato de sódio acumulam gotas lipídicas no citoplasma e apresentam características típicas de esteatose. Este modelo in vitro humano representa uma alternativa valiosa aos modelos in vivo dos ratos assim como aos hepatocytes humanos preliminares. Também apresentamos uma comparação de vários métodos para a quantificação e avaliação do acúmulo de gordura em células de HepaRG, incluindo coloração de óleo vermelho O, medida de Bodipy citofluimétrica, análise metabólica da expressão gênica por qPCR e anti-Stokes coerente Microscopia de espalhamento Raman (CARS). A imagem latente dos carros combina a especificidade química da espectroscopia de Raman, uma técnica da análise química conhecida em aplicações da ciência dos materiais, com os benefícios das microscopias óticas de alta velocidade, de alta resolução não-lineares para permitir a precisão quantificação da acumulação lipídica e da dinâmica das gotas lipídicas. O estabelecimento de um modelo in vitro eficiente para a indução da esteatose vesicular, ao lado de um método exato para a quantificação e caracterização do acúmulo lipídico, poderia levar ao desenvolvimento do diagnóstico de fase precoce da DHGNA através da identificação de marcadores moleculares, e à geração de novas estratégias de tratamento.

Introduction

A esteatose hepática é definida como acúmulo de gordura intrahepática, dentro de gotas lipídicas contendo triglicerídeos, de pelo menos 5% do peso do fígado. O armazenamento hepático prolongado de lipídios é um processo potencialmente reversível, no entanto, pode levar a disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), a causa predominante de doença hepática crônica em muitas partes do o mundo^1,2. A NAFLD é uma doença multifatorial que pode evoluir para a esteatohepatite não alcoólica mais agressiva (Nash), que por sua vez pode progredir para cirrose e, em pequena porcentagem de pacientes, para carcinoma hepatocelular (HCC)^1,3. Nenhuma terapia aprovada está atualmente disponível como um tratamento específico para a NAFLD e a combinação de modificações de dieta e estilo de vida continua sendo o pilar da NAFLD e da gerência de Nash^4,5,6.

Os mecanismos moleculars que conduzem ao desenvolvimento da esteatose hepatic na patogénese de NAFLD permanecem ainda para ser elucidados⁷. Neste contexto, modelos de camundongo foram desenvolvidos para estudar a progressão da doença da esteatose humana. Existe uma infinidade de modelos diferentes, e cada um tem suas vantagens e desvantagens, incluindo modelos genéticos, nutricionais e quimicamente induzidos combinando diferentes abordagens. Os ratos geneticamente modificados (transgênicos ou Knockout) desenvolvem espontaneamente a doença hepática. Entretanto, deve-se notar que estas mutações são muito raras nos seres humanos e o apagamento ou a excesso-expressão de um único gene (por exemplo, rato de OB/OB) não podem imitar a etiologia da doença humana multifatorial a nível molecular^8,9. Da mesma forma, a doença adquirida por camundongos após manipulação dietética ou farmacológica pode não imitar os efeitos das dietas humanas associadas ao desenvolvimento da DHGNA no homem⁸. Os modelos animais têm, no entanto, facilitado a evolução na compreensão da DHGNA e essa abordagem é atualmente a estratégia mais freqüentemente utilizada na pesquisa laboratorial. No entanto, a replicação em humanos dos resultados obtidos em modelos animais tem falhado repetidamente, causando má tradução para a clínica¹⁰.

Portanto, os modelos in vitro da DHGNA podem desempenhar um papel fundamental na elucidação dos mecanismos moleculares da progressão da NAFLD, e representam uma ferramenta valiosa para a tela de um grande número de compostos. Culturas de células primárias, linhas celulares imortalizadas e biópsias hepáticas têm sido amplamente utilizadas para fins de pesquisa¹¹. Os hepatócitos humanos preliminares assemelham-se pròxima às circunstâncias clínicas humanas, mas há um número limitado de doadores, e as culturas de pilha preliminares mostram a reprodutibilidade pobre devido à variabilidade das pilhas. Essas observações, juntamente com questões éticas e logísticas, resultaram no uso de hepatócitos primários humanos sendo limitados¹². Assim, as linhas de célula hepatic representam uma alternativa conveniente, tendo diversas vantagens essenciais sobre a cultura preliminar, porque as linhas de pilha hepatic crescem firmemente, têm uma vida-extensão quase ilimitada, e têm um phenotype estável. Além disso, as linhas celulares são facilmente acessíveis e as condições de cultura das linhagens celulares hepáticas são mais simples do que as dos hepatócitos primários e são padronizadas entre os diferentes laboratórios.

Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo Cell-Based in vitro da esteatose vesicular do fígado, representada por pilhas diferenciadas hepatic do HepaRG tratadas com o oleate do sódio do ácido gordo. A linha celular de HepaRG foi estabelecida de um paciente fêmea afetado pela infecção da hepatite C e por um tumor bem diferenciado do fígado da classe de Edmondson mim¹⁴. A linha celular HepaRG é uma linhagem de células progenitoras bipotentes humanas capaz de diferenciar a exposição a 2% de sulfóxido de dimetil (DMSO) em direção a dois fenótipos de células diferentes: células semelhantes às das vias biliares e hepatócitos. As células de HepaRG diferenciadas (dHepaRG) compartilham algumas características e propriedades com hepatócitos adultos e possuem a capacidade de expressar de forma estável genes específicos do fígado, como albumina, AldolaseB, citocromo P450 2E1 (CYP2E1) e citocromo P450 3A4 (CYP3A4)¹³ (passo 3). O tratamento de células de dheparg com o oleato de sódio de sal de ácidos graxos (250 μm) por 5 dias levam à geração de gotas lipídicas citoplasmáticas, imitando os efeitos do fígado gordo^14,15,17,18 ( Passo 4). A acumulação de gotas lipídicas pode ser facilmente detectada pela coloração de óleo vermelho O (passo 5), um corante lisocromo solúvel em gordura que mancha triglicérides neutros e lipídios vermelho-laranja. Para quantificar eficientemente os lipídios no dheparg gordo, aqui nós ilustramos a análise cytofluorimetric após a mancha com 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3A, 4a-diaza-s-indacene (bodipy 505/515) (etapa 6), uma sonda fluorescente lipofílico a corpos lipídicos intracelulares e tem sido usado para rotular gotas lipídicas¹⁹. Além disso, aqui nós mostramos como avaliar a esteatose pela reacção em cadeia quantitativa do polymerase (qPCR) (etapa 7) desregulação da expressão de gene de diversos genes metabólicos em pilhas de dHepaRG. Para caracterizar e quantificar ainda mais o acúmulo de gotas lipídicas após o tratamento com oleato de sódio, realizou-se a microscopia de espalhamento Raman (CARS) coerente de anti-Stokes (etapa 8), uma técnica inovadora que possibilita a visualização e quantificação de gotas lipídicas sem rotulagem^20,21.

Protocol

1. preparação de meios de cultura e reagentes Meio proliferating: suplemento de William E médio com GlutaMAX, 10% soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, 5 μg/mL de insulina e 0,5 μM hidrocortisona hemisuccinato. Meio de diferenciação: suplemento de William E meio com GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 50 μM de hidrocortisona hemisuccinato e 2% DMSO. Meio de congelação: suplemento proliferating médio com 10% DMSO. Oleato…

Representative Results

Este protocolo descreve um método eficiente para induzir e caracterizar o esteatose vesicular em pilhas DMSO-diferenciadas de heparg pelo tratamento do oleato do sódio (Figura 1a). Diferenciação de células HepaRG.Para induzir de forma eficiente a diferenciação, as células proliferantes devem ser semeadas em baixa densidade (2,5 x 104 células/cm2) no meio de proliferação. Quando semeadas em baix…

Discussion

Este protocolo descreve como diferenciar as células HepaRG e como induzir a esteatose vesicular pelo tratamento oleato de sódio (Figura 1A). Com efeito, em comparação com outras linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano (HCC), a linha celular heparg apresenta características de hepatócitos humanos adultos, representando uma valiosa alternativa aos hepatócitos humanos primários cultivados ex vivo^{13,14 </…}

Materials

Hyclone HyClone Fetal Clone II	GE Healthcare	SH30066
William’s E medium with GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillin/streptomycin	SIGMA	P4333
Insulin	SIGMA	I9278
hydrocortisone hemisuccinate	SIGMA	H2270
DMSO, dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2438
Sodium Oleate	SIGMA	O7501
Methanol	SIGMA	179337
Isopropanol	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Formaldehyde solution	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
Glass-bottomed dishes	Willco Wells	GWST-5040
Oil Red solution	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
b-actin FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
b-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMIN FOR	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMIN REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB FOR	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A FOR	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 FOR	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 FOR	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S FOR	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC