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신경과학

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

Published: November 05, 2019
doi:
10.3791/59845
, , , , , , , , ,
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences,São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo

Summary

成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。

Abstract

オルガオティピック、またはスライス培養物は、インビトロで機能する中枢神経系の側面をモデル化するために広く採用されている。神経科学におけるスライス培養の可能性にもかかわらず、成人の神経組織を用いた研究は、特にヒトの被験者からのもので、そのような培養物を調製する研究はまだ少ない。スライス培養を調製するための成人ヒト組織の使用は、げっ歯類(通常新生児)から産生されるスライスに欠ける成熟したヒト脳の典型的な特性を保持するので、ヒト神経病理学の理解を高めるために特に魅力的である神経組織。このプロトコルは、切除脳外科手術に提出された生きているヒトドナーから採取された脳組織を使用して、短期的な自由浮遊スライス培養を準備する方法を記述する。これらの培養物を用いた生化学的および細胞生物学アッセイを維持・実行する手順も提示される。代表的な結果は、典型的なヒト皮質積層がインビトロ(DIV4)で4日後にスライスに保存され、主要な神経細胞型の存在が予想されることを示す。さらに、DIV4のスライスは、有毒刺激(H2O2)に挑戦すると堅牢な細胞死を受け、このモデルが細胞死アッセイのプラットフォームとして機能する可能性を示します。この方法は、膜挿入物を使用して広く使用されているプロトコルに代わる、よりシンプルで費用対効果の高い代替手段であり、主に年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨される。最後に、プロトコルは、薬剤耐性側頭葉てんかんの外科的治療に提出された患者から採取された皮質組織を使用することに専念しているが、他の脳領域/状態から採取された組織もすべきであると主張されている。同様のフリーフローティングスライスカルチャーを生成するためのソースとみなされます。

Introduction

研究におけるヒトサンプルの使用は、人間の脳の病理を研究するための素晴らしい選択肢であり、現代の技術は、患者由来の組織を使用して堅牢かつ倫理的な実験のための新しい方法を開きました。成人の人間の脳から調製されたオルガノチピック/スライス培養のような方法は、光遺伝学1、電気生理学2、3、4、5、可塑性などのパラダイムでますます使用されている6,7,8,9, 神経毒性/神経保護10,11,12,13, 細胞療法14,薬物スクリーニング15,16,17, 遺伝学と遺伝子編集12,18,19,20, とりわけ、 より良い戦略として成人期の神経疾患を理解する。

ヒト脳病理の根底にあるメカニズムの理解は、多数の被験者を必要とする実験戦略に依存する。逆に、スライス培養の場合、ヒトサンプルへのアクセスは依然として困難であるが、単一の皮質サンプルから最大50個のスライスを生成する可能性は、複数のボランティアを募集する必要性を部分的に回避する。収集された組織21当たりの複製および実行アッセイの数。

脳の組織学的/スライス培養のためのいくつかのプロトコルが記載されています,古典的なオキュロドラフト22,23,ローラーチューブ24,25,26, 半透過性膜インターフェイス 27、28、29、30、およびフリーフローティングスライス31、32。実験計画の特異性に応じて、各手法には独自の長所と短所があります。成人ヒト脳からの短期、自由浮遊スライス培養は、Stoppiniら27で使用される方法よりも有利な場合もあるが、インビトロでの長期細胞生存は通常、評価する際に大きな関心事であるという事実を考慮すると培養方法では、多くの実験において、培養中の短期間のみが必要である12、31、32、33、34、35。これらの条件下で、自由浮遊培養物の使用は、よりシンプルで費用対効果が高いという利点を提示するだけでなく、2〜3週間にわたって培養中に保持されるスライスよりも、元のヒト組織の状態に正確に似ています。

スライス培養が神経科学に及む可能性があるにもかかわらず、成人の神経組織を用いてこのような培養物を調製する研究は、特にヒトの被験者からはまだ不足している。この記事では、切除脳手術に提出された生きているヒトドナーから収集した脳組織を使用して、自由浮遊スライス培養を準備するプロトコルについて説明する。これらの培養物を用いた生化学的および細胞生物学アッセイを維持・実行する手順を詳しく説明する。このプロトコルは、成人期に関連する神経病理学のメカニズムに関する研究において、生存率および神経機能を分析するために貴重であることが証明されている。

Protocol

生きた成人脳組織は、薬剤耐性側頭葉てんかんの治療のために切除神経外科手術を受けている患者から得られた(図1A)。すべての手続きは、リベイラン・プレト医科大学(17578/2015)の診療所病院の倫理委員会によって承認され、患者(またはその法的責任者)は、インフォームド・コンセント条項に同意し、署名しました。組織の収集は、てんかん手術センター(C…

Representative Results

培養スライスの品質と健康を評価する重要な側面は、予想される神経細胞型、ニューロン、およびグリア細胞の存在と典型的な形態である。ヒト皮質積層の典型的なアーキテクチャはDIV4のスライスで観察され、神経免疫標識によって明らかになった(図2D)。また、ミクログリアおよびアストログリア(図2B,C)の存在も認めら?…

Discussion

自由浮遊、短期スライス培養物を製造するためのこのプロトコルは、成人ヒトネオコルチカルスライスを培養するための代替方法である。スライス培養のためのこのようなプロトコルは、光遺伝学1、44、45、電気生理学2、3、4、5に関する研究に適している可能性があります。<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、FAPESP(グラント25681-3/2017からAS)、CAPES(ポストドクターフェローシップPNPD/INCT-HSMからA.F.、博士前フェローシップからN.D.M.)、FAEPAによってサポートされています。G.M.A.はFAPESP(MS 2018/06614-4)から修士号を取得しています。N.G.C.はCNPqリサーチフェローシップを開催しています。我々は、この研究のために切除された組織を寄付してくれた患者とその家族に感謝する。サンパウロ大学リベイラン・プレト医科大学臨床病院の住民、看護師、技術者、CIREPチームの支援を受け付けています。

Materials

2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 – VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 – ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ
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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).
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