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신경과학

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Published: November 05, 2019
doi:
10.3791/59845
, , , , , , , , ,
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences,São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo

Summary

Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l’esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all’età.

Abstract

Organotipica, o colture di fette, sono state ampiamente impiegate per modellare aspetti del funzionamento del sistema nervoso centrale in vitro. Nonostante il potenziale delle colture di fette nelle neuroscienze, gli studi che utilizzano il tessuto nervoso adulto per preparare tali culture sono ancora scarse, in particolare quelle provenienti da soggetti umani. L’uso di tessuto umano adulto per preparare le colture di fette è particolarmente interessante per migliorare la comprensione delle neuropatologie umane, in quanto contengono proprietà uniche tipiche del cervello umano maturo privo di fette prodotte da roditori (di solito neologati) tessuto nervoso. Questo protocollo descrive come utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette a breve termine, galleggianti libere. Vengono inoltre presentate procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture. I risultati rappresentativi dimostrano che la tipica laminazione corticale umana è conservata in fette dopo 4 giorni in vitro (DIV4), con la presenza prevista dei principali tipi di cellule neurali. Inoltre, le fette al DIV4 subiscono una robusta morte cellulare quando vengono sfidate con uno stimolo tossico (H2O2), indicando il potenziale di questo modello per fungere da piattaforma nei saggi di morte cellulare. Questo metodo, un’alternativa più semplice ed economica al protocollo ampiamente usato utilizzando inserti di membrana, è raccomandato principalmente per l’esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all’età. Infine, sebbene il protocollo sia dedicato all’utilizzo del tessuto corticale raccolto da pazienti sottoposti al trattamento chirurgico dell’epilessia del lobo temporale farmacoresistente, si sostiene che anche i tessuti raccolti da altre regioni/condizioni cerebrali per produrre simili colture di fette a flotta ntetto.

Introduction

L’uso di campioni umani nella ricerca è inequivocabilmente una grande opzione per studiare le patologie cerebrali umane, e le tecniche moderne hanno aperto nuovi modi per la sperimentazione robusta ed etica utilizzando tessuti derivati dal paziente. Metodi come le colture organotipiche/fette preparate dal cervello umano adulto sono stati sempre più utilizzati in paradigmi come l’optogenetica1, l’elettrofisiologia2,3,4,5, plasticità 6,7,8,9,neurotossicità/neuroprotezione10,11,12,13, terapia cellulare14, screening farmacologico15,16,17, genetica e genetica editing12,18,19,20, tra gli altri, come strategia per la migliore neurologiche durante l’età adulta.

La comprensione dei meccanismi alla base delle patologie cerebrali umane dipende da strategie sperimentali che richiedono un gran numero di soggetti. Al contrario, nel caso delle colture di fette, anche se l’accesso a campioni umani è ancora difficile, la possibilità di generare fino a 50 fette da un singolo campione corticale elude parzialmente la necessità di reclutare più volontari aumentando la numero di repliche ed esegue saggi per tessuto raccolto21.

Sono stati descritti diversi protocolli per le colture organotipiche/fette cerebrali, che vanno dalle classiche bozze oculo22,23 al tubo a rulli24,25,26, membrane semipermeabili l’interfaccia27,28,29,30e le sezioni free-floating31,32. A seconda delle particolarità di un progetto sperimentale, ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Le colture di fette a breve termine e fluttuanti da cervelli umani adulti sono in alcuni casi vantaggiose rispetto al metodo utilizzato da Stoppini et al.27, se si considera il fatto che sebbene la sopravvivenza cellulare a lungo termine in vitro sia di solito una delle principali preoccupazioni quando si valuta un metodo di coltura, in molti esperimenti sono necessari solo brevi periodi di tempo nella coltura12,31,32,33,34,35. In queste condizioni, l’uso di colture a flottante presenta il vantaggio di essere più semplice e più conveniente, oltre a assomigliare in modo più accurato alla condizione originale del tessuto umano rispetto alle fette mantenute in coltura per 2-3 settimane.

Nonostante il potenziale delle colture di fette alle neuroscienze, gli studi sull’uso del tessuto nervoso adulto per preparare tali colture sono ancora scarse, in particolare da soggetti umani. Questo articolo descrive un protocollo per utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette galleggianti libere. Le procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture sono dettagliate. Questo protocollo si è dimostrato prezioso per analizzare la vitalità e la funzione neuronale nelle indagini sui meccanismi delle neuropatologie legate all’età adulta.

Protocol

Tessuti cerebrali adulti vivi sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a neurochirurgia resective per il trattamento dell’epilessia del lobo temporale farmacoresistente (Figura 1A). Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell’Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto (17578/2015) e i pazienti (o la loro persona responsabile legale) hanno concordato e firmato i termini di consenso informato. La raccolta del tessuto è stata effettuata dal team d…

Representative Results

Un aspetto critico per valutare la qualità e la salute delle fette coltivate è la presenza e la morfologia tipica dei tipi di cellule neurali previste, neuroni e cellule gliali. L’architettura tipica della laminazione corticale umana è stata osservata in una fetta al DIV4, rivelata dall’immunoetichettatura neuronale (Figura 2D). Inoltre, è stata osservata anche la prevista presenza di microglia e astroglia (Figura 2B,C). Que…

Discussion

Questo protocollo per la produzione di colture di fette a breve termine e galleggianti è un metodo alternativo per coltivare fette neocorticali umane adulte. Tale protocollo per le colture di fette può essere suscettibile di studi su (ma non limitato a) optogenetica1,44,45, elettrofisiologia2,3,4,5 ,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato da FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) e FAEPA. G.M.A. ha conseguito una borsa di studio faPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. ha conseguito una borsa di studio CNPq Research. Ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato i tessuti resezionati per questo studio. Vorremmo riconoscere il supporto dei residenti, delle infermiere, dei tecnici e del team CIREP, dell’Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto, dell’Università di San Paolo, che ha contribuito in varie fasi del processo.

Materials

2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 – VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 – ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ
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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).
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