Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l’esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all’età.
Organotipica, o colture di fette, sono state ampiamente impiegate per modellare aspetti del funzionamento del sistema nervoso centrale in vitro. Nonostante il potenziale delle colture di fette nelle neuroscienze, gli studi che utilizzano il tessuto nervoso adulto per preparare tali culture sono ancora scarse, in particolare quelle provenienti da soggetti umani. L’uso di tessuto umano adulto per preparare le colture di fette è particolarmente interessante per migliorare la comprensione delle neuropatologie umane, in quanto contengono proprietà uniche tipiche del cervello umano maturo privo di fette prodotte da roditori (di solito neologati) tessuto nervoso. Questo protocollo descrive come utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette a breve termine, galleggianti libere. Vengono inoltre presentate procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture. I risultati rappresentativi dimostrano che la tipica laminazione corticale umana è conservata in fette dopo 4 giorni in vitro (DIV4), con la presenza prevista dei principali tipi di cellule neurali. Inoltre, le fette al DIV4 subiscono una robusta morte cellulare quando vengono sfidate con uno stimolo tossico (H2O2), indicando il potenziale di questo modello per fungere da piattaforma nei saggi di morte cellulare. Questo metodo, un’alternativa più semplice ed economica al protocollo ampiamente usato utilizzando inserti di membrana, è raccomandato principalmente per l’esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all’età. Infine, sebbene il protocollo sia dedicato all’utilizzo del tessuto corticale raccolto da pazienti sottoposti al trattamento chirurgico dell’epilessia del lobo temporale farmacoresistente, si sostiene che anche i tessuti raccolti da altre regioni/condizioni cerebrali per produrre simili colture di fette a flotta ntetto.
L’uso di campioni umani nella ricerca è inequivocabilmente una grande opzione per studiare le patologie cerebrali umane, e le tecniche moderne hanno aperto nuovi modi per la sperimentazione robusta ed etica utilizzando tessuti derivati dal paziente. Metodi come le colture organotipiche/fette preparate dal cervello umano adulto sono stati sempre più utilizzati in paradigmi come l’optogenetica1, l’elettrofisiologia2,3,4,5, plasticità 6,7,8,9,neurotossicità/neuroprotezione10,11,12,13, terapia cellulare14, screening farmacologico15,16,17, genetica e genetica editing12,18,19,20, tra gli altri, come strategia per la migliore neurologiche durante l’età adulta.
La comprensione dei meccanismi alla base delle patologie cerebrali umane dipende da strategie sperimentali che richiedono un gran numero di soggetti. Al contrario, nel caso delle colture di fette, anche se l’accesso a campioni umani è ancora difficile, la possibilità di generare fino a 50 fette da un singolo campione corticale elude parzialmente la necessità di reclutare più volontari aumentando la numero di repliche ed esegue saggi per tessuto raccolto21.
Sono stati descritti diversi protocolli per le colture organotipiche/fette cerebrali, che vanno dalle classiche bozze oculo22,23 al tubo a rulli24,25,26, membrane semipermeabili l’interfaccia27,28,29,30e le sezioni free-floating31,32. A seconda delle particolarità di un progetto sperimentale, ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Le colture di fette a breve termine e fluttuanti da cervelli umani adulti sono in alcuni casi vantaggiose rispetto al metodo utilizzato da Stoppini et al.27, se si considera il fatto che sebbene la sopravvivenza cellulare a lungo termine in vitro sia di solito una delle principali preoccupazioni quando si valuta un metodo di coltura, in molti esperimenti sono necessari solo brevi periodi di tempo nella coltura12,31,32,33,34,35. In queste condizioni, l’uso di colture a flottante presenta il vantaggio di essere più semplice e più conveniente, oltre a assomigliare in modo più accurato alla condizione originale del tessuto umano rispetto alle fette mantenute in coltura per 2-3 settimane.
Nonostante il potenziale delle colture di fette alle neuroscienze, gli studi sull’uso del tessuto nervoso adulto per preparare tali colture sono ancora scarse, in particolare da soggetti umani. Questo articolo descrive un protocollo per utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette galleggianti libere. Le procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture sono dettagliate. Questo protocollo si è dimostrato prezioso per analizzare la vitalità e la funzione neuronale nelle indagini sui meccanismi delle neuropatologie legate all’età adulta.
Questo protocollo per la produzione di colture di fette a breve termine e galleggianti è un metodo alternativo per coltivare fette neocorticali umane adulte. Tale protocollo per le colture di fette può essere suscettibile di studi su (ma non limitato a) optogenetica1,44,45, elettrofisiologia2,3,4,5 ,…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato da FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) e FAEPA. G.M.A. ha conseguito una borsa di studio faPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. ha conseguito una borsa di studio CNPq Research. Ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato i tessuti resezionati per questo studio. Vorremmo riconoscere il supporto dei residenti, delle infermiere, dei tecnici e del team CIREP, dell’Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto, dell’Università di San Paolo, che ha contribuito in varie fasi del processo.
2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
TEMED | GE | 17-1312-01 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
Equipment and Material | |||
24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
Motorized pestle | Kimble Chase | ||
Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
Vibratome | Leica | 14047235612 – VT1000S | |
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 – ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
Entellan | Merck | 107960 | |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |