In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts
Summary
Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.
Abstract
Tumor angiogenese is een belangrijk doelwit van anti-kankertherapie en deze methode is ontwikkeld om een nieuw model te bieden om dit proces in vivo te bestuderen. Een zebravis xenotransplantaatmodellen is wordt gecreëerd door het implanteren van zoogdieren tumorcellen in de perivitelline ruimte van twee dagen-post-bemesting zebravis embryo’s, gevolgd door het meten van de mate van de angiogene respons waargenomen bij een experimenteel eindpunt tot twee dagen na implantatie. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de zebravis host angiogene reactie op het transplantaat nauwkeurig te Kwantificeer. Dit maakt gedetailleerd onderzoek van de moleculaire mechanismen en de bijdrage van gastheer versus tumor aan de angiogene respons mogelijk. De xenografted embryo’s kunnen worden onderworpen aan een verscheidenheid aan behandelingen, zoals incubatie met potentiële anti-angiogenese medicijnen, om strategieën voor de remming van de tumor angiogenese te onderzoeken. De angiogene respons kan ook live-imaged zijn om meer dynamische cellulaire processen te onderzoeken. De relatief onveeleisende experimentele techniek, goedkope onderhoudskosten van zebravis en korte experimentele tijdlijn maken dit model vooral nuttig voor de ontwikkeling van strategieën om de tumor angiogenese te manipuleren.
Introduction
Angiogenese is een van de klassieke kenmerken van kanker en vertegenwoordigt een doelwit van anti-kankertherapie1,2. Om dit proces te bestuderen, xenotransplantaatmodellen is modellen van kanker zijn gemaakt door het implanteren van zoogdier tumorcellen in dieren zoals muizen3. Een zebravis xenotransplantaatmodellen is model is ook ontwikkeld, waarbij de implantatie van tumorcellen in 2 dagen post fertilisatie (dpi) zebravis die resulteert in een snelle groei van zebravis bloedvaten in de xenotransplantaatmodellen is4.
Dit protocol beschrijft een in vivo zebravis embryo tumor xenotransplantaatmodellen is model waarin de angiogene respons nauwkeurig kan worden gekwantificeerd over de gehele xenotransplantaatmodellen is. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om in vivo de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de tumor angiogene respons ondersteunen. De genetische traceerbaarheid van de zebravissen maakt het mogelijk de gastheer bijdrage te ondervragen, terwijl de selectie van verschillende tumor cellijnen toestaat dat de tumor bijdrage aan angiogenese ook wordt onderzocht5,6,7. Bovendien, als zebravis larven zijn permeabel voor kleine moleculen, specifieke pathway remmers kunnen worden gebruikt of drug bibliotheken kunnen worden gescreend om te identificeren van de nieuwe remmers van tumor angiogenese8,9,10, 11.
Het zebravis embryo xenotransplantaatmodellen is model presenteert unieke voordelen ten opzichte van andere zoogdier xenotransplantaatmodellen is modellen. Zebravis xenotransplantaten zijn goedkoper en gemakkelijker uit te voeren, grote aantallen dieren kunnen worden onderzocht en live-celbeeldvorming laat gedetailleerd onderzoek van het Celgedrag toe4. In tegenstelling tot andere in vivo-modellen, die tot enkele weken nodig hebben om significante bloedvat groei te observeren, kan angiogenese in zebravis xenotransplantaten worden waargenomen binnen 24 uur na implantatie3,4. Het ontbreken van een adaptief immuunsysteem in embryonale zebravis, terwijl het gunstig is voor het behoud van de xenograft, betekent echter dat de adaptieve immuunrespons en zijn bijdrage aan de tumor angiogenese niet kunnen worden onderzocht. Bovendien zijn het gebrek aan tumor stromale cellen, het onvermogen om de tumor orthotopisch te implanteren en het verschil in onderhouds temperatuur tussen zebravis en zoogdiercellen potentiële zwakke punten van deze methode. Niettemin, de geschiktheid van dit model voor Live beeldvorming en de mogelijkheid om de angiogene respons nauwkeurig te kwantificen maakt het uniek gunstig voor het bestuderen van de cellulaire processen die de tumor angiogenese in vivo reguleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eerste kritieke stap in het protocol is de implantatie van tumorcellen. Het is essentieel dat cellen worden geïnjecteerd in een locatie die de xenotransplantaatmodellen is in staat stelt om met succes in het embryo te implanteren zonder het embryo edematous te maken. Een te anterieure injectie kan de cellen in de richting van het hart laten bewegen, de bloedbaan blokkeren en tot oedeem leiden, terwijl een injectie die te posterieure is, een slecht geïmplanteerde xenograft zal veroorzaken. Een voorste injectie wordt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de heer alhad mahagaonkar voor het beheer van de Universiteit van Auckland zebravis Facility en de biomedische beeldvormings onderzoekseenheid, school voor medische wetenschappen, Universiteit van Auckland, voor hulp bij time-lapse confocale microscopie. Dit werk werd gesteund door een Health Research Council van Nieuw-Zeeland project Grant (14/105), een Royal Society of Nieuw-Zeelandse Marsden Fonds project Grant (UOA1602) en een Auckland Medical Research Foundation project Grant (1116012) toegekend aan J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. 암 연구학. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. 암 연구학. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. 발생학. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. 암 연구학. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. 암 연구학. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
