In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts
Summary
Ziel dieser Methode ist es, ein In-vivo-Modell der Tumorangiogenese zu generieren, indem Säugetiertumorzellen in einen Zebrafisch-Embryo mit fluoreszierend gekennzeichneten Blutgefäßen gexlüftet werden. Durch die Abbildung des Xenografts und der zugehörigen Gefäße kann eine quantitative Messung der angiogenen Reaktion erreicht werden.
Abstract
Tumorangiogenese ist ein wichtiges Ziel der Anti-Krebs-Therapie und diese Methode wurde entwickelt, um ein neues Modell zur Untersuchung dieses Prozesses in vivo zur Verfügung zu stellen. Ein Zebrafisch-Xenograft entsteht, indem Säugetiertumorzellen in den Perivitelinraum von zwei Tagen nach der Befruchtung von Zebrafischembryonen implantiert werden, gefolgt von der Messung des Ausmaßes der angiogenen Reaktion, die an einem experimentellen Endpunkt bis zu zwei Tage beobachtet wurde. Nachderimplantation. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, die Angiogene Reaktion des Zebrafische-Wirts auf das Transplantat genau zu quantifizieren. Dies ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der molekularen Mechanismen sowie des Wirts- vs.-Tumorbeitrags zur angiogenen Reaktion. Die xenografierten Embryonen können einer Vielzahl von Behandlungen unterzogen werden, wie z. B. der Inkubation mit potenziellen Anti-Angiogenese-Medikamenten, um Strategien zur Hemmung der Tumorangiogenese zu untersuchen. Die angiogene Reaktion kann auch live abgebildet werden, um dynamischere zelluläre Prozesse zu untersuchen. Die relativ anspruchslose Versuchstechnik, die günstigen Wartungskosten von Zebrafischen und die kurze experimentelle Zeitleiste machen dieses Modell besonders nützlich für die Entwicklung von Strategien zur Manipulation der Tumorangiogenese.
Introduction
Angiogenese ist eines der klassischen Kennzeichen von Krebs und stellt ein Ziel der Anti-Krebs-Therapie1,2. Um diesen Prozess zu untersuchen, wurden Xenograft-Modelle von Krebs durch implantieren Säugetier Tumorzellen in Tiere wie Mäuse3erstellt. Es wurde auch ein Zebrafisch-Xenograft-Modell entwickelt, das die Implantation von Tumorzellen in 2 Tage nach der Befruchtung (dpi) Zebrafische beinhaltet, was zu einem schnellen Wachstum von Zebrafisch-Blutgefäßen in das Xenograft4führt.
Dieses Protokoll beschreibt ein in vivo Zebrafisch-Embryo-Tumor-Xenograft-Modell, bei dem die angiogene Reaktion über das gesamte Xenograft genau quantifiziert werden kann. Diese Methode ermöglicht es dem Forscher, in vivo die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die angiogene Reaktion des Tumors untermauern. Die genetische Traktionsfähigkeit des Zebrafisches ermöglicht die Vernehmung des Wirtsbeitrags, während die Auswahl verschiedener Tumorzelllinien die Tumorbeteiligung zur Angiogenese ebenfalls untersuchen kann5,6,7. Darüber hinaus können, da Zebrafischlarven für kleine Moleküle durchlässig sind, spezifische Signalweginhibitoren verwendet oder Arzneimittelbibliotheken untersucht werden, um neuartige Inhibitoren der Tumorangiogenese8,9,10, 11.
Das Zebrafisch-Embryo-Xenograft-Modell bietet einzigartige Vorteile im Vergleich zu anderen Säugetier-Xenograft-Modellen. Zebrafisch Xenografts sind billiger und einfacher durchzuführen, eine große Anzahl von Tieren kann untersucht werden und Live-Zell-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung des Zellverhaltens4. Im Gegensatz zu anderen In-vivo-Modellen, die bis zu mehreren Wochen benötigen, um ein signifikantes Gefäßwachstum zu beobachten, kann die Angiogenese in Zebrafisch-Xenografts innerhalb von 24 h nach der Implantation3,4beobachtet werden. Das Fehlen eines adaptiven Immunsystems bei embryonalen Zebrafischen ist jedoch vorteilhaft für die Aufrechterhaltung des Xenografts, was jedoch bedeutet, dass die adaptive Immunantwort und ihr Beitrag zur Tumorangiogenese nicht untersucht werden können. Darüber hinaus sind der Mangel an Tumorstromzellen, die Unfähigkeit, den Tumor orthotopisch zu implantieren, und der Unterschied in der Erhaltungstemperatur zwischen Zebrafischen und Säugetierzellen potenzielle Schwächen dieser Methode. Nichtsdestotrotz macht die Amenabilität dieses Modells für Live-Bildgebung und die Fähigkeit, die angiogene Reaktion genau zu quantifizieren, es einzigartig vorteilhaft für die Untersuchung der zellulären Prozesse, die die Tumorangiogenese in vivo regulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der erste kritische Schritt im Protokoll ist die Implantation von Tumorzellen. Es ist wichtig, dass Zellen an einen Ort injiziert werden, der es dem Xenograft ermöglicht, erfolgreich in den Embryo zu implantieren, ohne den Embryo ödematend zu machen. Eine zu vordere Injektion kann es den Zellen ermöglichen, sich in Richtung Herz zu bewegen, die Blutbahn zu blockieren und zu Ödemen zu führen, während eine zu hintere Injektion zu einem schlecht implantierten Xenograft führt. Eine vordere Injektion wird am besten ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Alhad Mahagaonkar für die Leitung der Zebrafischanlage der University of Auckland und der Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland, für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie im Zeitraffer. Diese Arbeit wurde durch ein Health Research Council of New Zealand Project Grant (14/105), ein Royal Society of New Zealand Marsden Fund Project Grant (UOA1602) und einen Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) unterstützt, der J.W.A. verliehen wurde.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
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