ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量
Summary
この方法の目的は、哺乳類腫瘍細胞を蛍光標識血管を有するゼブラフィッシュ胚に異種移植することにより、腫瘍血管新生の生体内モデルを生成することである。異種移植片および関連する血管をイメージングすることにより、血管新生応答の定量的測定が得られる。
Abstract
腫瘍血管新生は抗癌治療の主要な標的であり、この方法は、生体内でこのプロセスを研究するための新しいモデルを提供するために開発されました。ゼブラフィッシュ異種移植片は、哺乳類の腫瘍細胞を2日後受精後ゼブラフィッシュ胚の周食空間に移植し、続いて実験エンドポイントで観察された血管新生応答の程度を2日まで測定することによって作成される。移植後。この方法の主な利点は、ジッタフィッシュ宿主血管新生応答を移植片に正確に定量する能力である。これにより、血管新生応答に対する宿主対腫瘍の寄与と同様に、分子機構の詳細な検査が可能になります。異種移植胚は、腫瘍血管新生を阻害する戦略を調べるために、潜在的な抗血管新生薬によるインキュベーションなどの様々な治療を受けることができる。血管新生応答はまた、より動的な細胞プロセスを調べるために生画像化することができる。比較的要求の厳しい実験技術、ゼブラフィッシュの安価なメンテナンスコスト、短い実験タイムラインにより、このモデルは腫瘍血管新生を操作する戦略の開発に特に役立ちます。
Introduction
血管新生は、癌の古典的な特徴の一つであり、抗癌治療1、2の標的を表す。このプロセスを研究するために、癌の異種移植片モデルは、マウス3などの動物に哺乳類腫瘍細胞を移植することによって作成された。ゼブラフィッシュ異種移植片モデルも開発されており、これは、ゼブラフィッシュ血管の異種移植片4への急速な成長をもたらす2日後受精(dpi)ゼブラフィッシュに腫瘍細胞を移植することを含む。
このプロトコルは、血管新生応答が異種移植片全体にわたって正確に定量することができる生体内ゼブラフィッシュ胚異種移植片モデルについて説明する。この方法により、研究者は、腫瘍血管新生応答を支える分子機構を生体内で調べることができます。ゼブラフィッシュの遺伝的管分性は、宿主の寄与を尋問することを可能にするが、異なる腫瘍細胞株の選択は血管新生に対する腫瘍寄与も5、6、7を調べることができる。さらに、ゼブラフィッシュ幼虫が小分子に透過性であるとして、特異的経路阻害剤を用いることができるか、または薬物ライブラリーをスクリーニングして腫瘍血管新生8、9、10、腫瘍血管新生の新規阻害剤を同定することができる。 11.
ゼブラフィッシュ胚異種移植片モデルは、他の哺乳類異種移植片モデルと比較してユニークな利点を提示します。ゼブラフィッシュ異種移植片は、より安価で実行しやすく、多数の動物を検査することができ、生細胞イメージングは、細胞行動の詳細な検査を可能にする4。顕著な血管の成長を観察するために数週間を必要とする他の生体内モデルとは異なり、ゼブラフィッシュ異種移植片の血管新生は、移植3、4の後24時間以内に観察することができる。しかしながら、胚性ゼブラフィッシュにおける適応免疫系の欠如は、異種移植片を維持するのに有益である一方で、適応免疫応答および腫瘍血管新生に対するその寄与を調べることができないことを意味する。加えて、腫瘍間質細胞の欠如、腫瘍を矯東的に移植できないこと、およびゼブラフィッシュと哺乳動物細胞間の維持温度の差がこの方法の潜在的な弱点である。それにもかかわらず、ライブイメージングのためのこのモデルのアメニティと血管新生応答を正確に定量する能力は、生体内で腫瘍血管新生を調節する細胞プロセスを研究するために独特に有益になります。
Protocol
1. マイクロインジェクション針の調製 マイクロピペットプーラーをオンにし、次のパラメータを設定します(材料の表に記載されているマイクロピペットプーラーモデルのために校正):熱、680;プル, 75;速度, 40;時間, 55;圧力: 530. マイクロピペットプーラーにホウケイ酸塩ガラスキャピラリーを固定し、毛細血管を引っ張って2本の針を作ります。必要な数の針に対し?…
Representative Results
6、24および48 hpiで個々の異種移植片をイメージングすることにより、異なる時点での血管新生応答を図1A-Cに示すように計算することができる。最大の血管新生応答は、24〜48時間の移植後の間に観察され、移植片血管の最大レベルは2 dpiの周りに見られる(図1A-C)。補足ムービー1で見られる20.75馬力?…
Discussion
プロトコルの最初の重要なステップは、腫瘍細胞の移植です。細胞を胚を脳に付着させることなく、異種移植片が胚に正常に移植できる場所に注入することが不可欠である。あまりにも前の注射は、細胞が心臓に向かって移動することを可能にし、血流を遮断し、子宮内腫につながる一方で、後部である注射は、不十分な移植異種移植片をもたらす。前部注射は、注入時に心臓から離れるよ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オークランド大学ゼブラフィッシュ施設とオークランド大学医学部生物医学イメージング研究ユニットを管理してくださったアルハド・マハガオンカー氏に感謝します。この研究は、ニュージーランドプロジェクト助成金の健康研究評議会(14/105)、ニュージーランド王立協会マースデン基金プロジェクト助成金(UOA1602)、オークランド医学研究財団プロジェクト助成金(1116012)によって支援されました。
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
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Cite This Article
Britto, D. D., Hall, C. J., Astin, J. W. In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (150), e59849, doi:10.3791/59849 (2019).