In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish
Summary
O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.
Abstract
A angiogênese tumoral é um alvo-chave da terapia anticancerígena e este método foi desenvolvido para fornecer um novo modelo para estudar este processo in vivo. Um Xenoenxerto de zebrafish é criado através da implantação de células tumorais de mamíferos no espaço perivitelínico de dois dias-embriões de zebrafish pós-fertilização, seguidos pela mensuração da extensão da resposta angiogênica observada em um desfecho experimental até dois dias pós-implante. A vantagem chave a este método é a habilidade de quantificar exatamente a resposta angiogênica do anfitrião do zebrafish ao enxerto. Isto permite a examinação detalhada dos mecanismos moleculars assim como o anfitrião contra a contribuição do tumor à resposta angiogênica. Os embriões xenografados podem ser submetidos a uma variedade de tratamentos, como a incubação com potenciais fármacos antiangiogénese, a fim de investigar estratégias para inibir a angiogênese tumoral. A resposta angiogênica também pode ser imaged ao vivo, a fim de examinar processos celulares mais dinâmicos. A técnica experimental relativamente pouco exigente, custos de manutenção baratos de zebrafish e curto cronograma experimental tornam este modelo especialmente útil para o desenvolvimento de estratégias para manipular a angiogênese tumoral.
Introduction
A angiogênese é uma das características clássicas do câncer e representa um alvo de terapia anticancerígena1,2. Para estudar esse processo, foram criados modelos de câncer de Xenoenxerto, implantando células tumorais de mamíferos em animais como camundongos3. Um modelo do xenograft do zebrafish foi desenvolvido igualmente, que envolva a implantação de pilhas do tumor em 2 dias do borne da fertilização (DPI) zebrafish que conduz ao crescimento rápido de vasos sanguíneos do zebrafish no xenograft4.
Este protocolo descreve um modelo in vivo do xenograft do tumor do embrião do zebrafish em que a resposta angiogênica pode com precisão ser quantificados através do xenograft inteiro. Este método permite que o investigador examine, in vivo, os mecanismos moleculares que sustentam a resposta angiogênica do tumor. A tractabilidade genética do zebrafish permite que a contribuição do hospedeiro seja interrogada, enquanto a seleção de diferentes linhagens celulares tumorais permite que a contribuição tumoral para a angiogênese também seja examinada5,6,7. Além disso, como larvas de zebrafish são permeáveis a pequenas moléculas, inibidores de vias específicas podem ser usados ou bibliotecas de drogas podem ser rastreadas para identificar novos inibidores da angiogênese tumoral8,9,10, o 11.
O modelo de Xenoenxerto de embrião zebrafish apresenta vantagens únicas em comparação com outros modelos de xenoenxertos de mamíferos. Os xenoenxertos de zebrafish são mais baratos e mais fáceis de executar, um grande número de animais pode ser examinado e a imagem latente viva da pilha permite a examinação detalhada do comportamento da pilha4. Ao contrário de outros modelos in vivo, que requerem até várias semanas para observar o crescimento significativo dos vasos, a angiogênese em xenoenxertos de zebrafish pode ser observada dentro de 24 h após a implantação3,4. No entanto, a falta de um sistema imunológico adaptativo em zebrafish embrionário, embora benéfica para a manutenção do Xenoenxerto, significa que a resposta imune adaptativa e sua contribuição para a angiogênese tumoral não podem ser examinadas. Além, a falta de pilhas stromal do tumor, a inabilidade ao implante ortotópica o tumor e a diferença na temperatura da manutenção entre zebrafish e pilhas mamífero são fraquezas potenciais deste método. No entanto, a amenabilidade deste modelo para imagens ao vivo e a capacidade de quantitizar com precisão a resposta angiogênica torna-o excepcionalmente benéfico para o estudo dos processos celulares que regulam a angiogênese tumoral in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O primeiro passo crítico no protocolo é a implantação de células tumorais. É essencial que as células são injetadas em um local que permitirá que o xenograft implante com sucesso no embrião sem fazer o embrião edematoso. Uma injeção que é muito anterior pode permitir que as células se movam em direção ao coração, bloqueando a corrente sanguínea e levando ao edema, enquanto uma injeção que é muito posterior resultará em um Xenoenxerto mal implantado. Uma injeção anterior é melhor evitada introdu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Sr. Alhad Mahagaonkar pela gestão da instalação de zebrafish da Universidade de Auckland e pela unidade de pesquisa de imagens biomédicas, escola de ciências médicas da Universidade de Auckland, para assistência na microscopia confocal de lapso de tempo. Este trabalho foi apoiado por um Conselho de pesquisa em saúde da Nova Zelândia projeto Grant (14/105), uma sociedade real de Nova Zelândia Marsden Fund Project Grant (UOA1602) e um Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) concedido a J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
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