Summary

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Published: August 14, 2019
doi:

Summary

Bu yöntemin amacı, memeli tümör hücrelerini floresan etiketli kan damarlarıolan zebra balığı embriyosuna xenografting ederek tümör anjiyogenezinin in vivo modelini oluşturmaktır. Ksenogreft ve ilişkili damarların görüntülenmesiyle anjiyojenik yanıtın kantitatif ölçümü elde edilebilir.

Abstract

Tümör anjiyogenez anti-kanser tedavisinin önemli bir hedefi dir ve bu yöntem in vivo bu süreci incelemek için yeni bir model sağlamak için geliştirilmiştir. Bir zebrabalığı ksenograft iki gün-post-fertilizasyon zebrabalığı embriyolarının perivitellin uzayına memeli tümör hücreleri implante tarafından oluşturulur, iki güne kadar deneysel bir bitiş noktasında gözlenen anjiyojenik yanıtın derecesini ölçme takip implantasyon sonrası. Bu yöntemin en önemli avantajı, zebra balığının grefte anjiyojenik yanıtı doğru bir şekilde belirleyebilme yeteneğidir. Bu, moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesini ve anjiyojenik yanıta konak vs tümör katkısının incelenmesini sağlar. Ksenogreftli embriyolar, tümör anjiyogenezi inhibe etme stratejilerini araştırmak için potansiyel anti-anjiyogenez ilaçları ile kuluçka gibi çeşitli tedavilere tabi tutulabilir. Anjiyojenik yanıt da daha dinamik hücresel süreçleri incelemek için canlı görüntülenebilir. Nispeten talepsiz deneysel teknik, zebra balığının ucuz bakım maliyetleri ve kısa deneysel zaman çizelgesi bu modeli tümör anjiyogenezi manipüle etme stratejilerinin geliştirilmesi için özellikle yararlı hale getirmektedir.

Introduction

Anjiyogenez kanserin klasik özelliklerinden biridir ve anti-kanser tedavisinin bir hedef temsil eder1,2. Bu süreci incelemek için, kanser ksenogreft modelleri fareler gibi hayvanlara memeli tümör hücreleri implante tarafından oluşturulmuştur3. Bir zebrabalığı ksenogreft modeli de geliştirilmiştir, hangi içine tümör hücrelerinin implantasyonu içerir 2 gün sonrası döllenme (dpi) zebra balığı içine zebrabalığı kan damarlarının hızlı büyüme ile sonuçlanır4.

Bu protokol, anjiyojenik yanıtın tüm ksenogreft boyunca doğru bir şekilde ölçülebileceği in vivo zebrabalığı embriyo tümör ksenogreft modelini tanımlar. Bu yöntem araştırmacı, in vivo, tümör anjiyojenik yanıtı destekleyen moleküler mekanizmaları incelemek için izin verir. Zebra balığının genetik sistemlenebilirliği konak katkısının sorgulanmasını sağlarken, farklı tümör hücre hatlarının seçilmesi tümör katkısının anjiyogeneze katkısının da incelenmesini sağlar5,6,7. Buna ek olarak, zebra balığı larvaları küçük moleküllere geçirgen olduğundan, spesifik yol inhibitörleri kullanılabilir veya ilaç kütüphaneleri tümör anjiyogenezinin yeni inhibitörlerini belirlemek için taranabilir8,9,10, 11. Yıl.

Zebrabalığı embriyo ksenograft modeli diğer memeli ksenogreft modellerine göre benzersiz avantajlar sunar. Zebrabalığı ksenogreftleri daha ucuz ve daha kolay yapılır, çok sayıda hayvan incelenebilirve canlı hücre görüntüleme hücre davranışının detaylı incelenmesine olanak sağlar 4. Önemli damar büyümesini gözlemlemek için birkaç haftaya kadar gerektiren diğer in vivo modellerinaksine, zebrabalığı ksenogreftlerinde anjiyogenez implantasyon dan sonra 24 saat içinde görülebilir3,4. Ancak, embriyonik zebra balığında adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, ksenogreftin sürdürülmesinde yararlı olmakla birlikte, adaptif immün yanıtın ve tümör anjiyogenezine olan katkısının incelenemeyeceği anlamına gelir. Buna ek olarak, tümör stromal hücrelerinin eksikliği, ortokik olarak tümörün implante edilememesi ve zebra balığı ile memeli hücreleri arasındaki bakım sıcaklığı farkı bu yöntemin potansiyel zayıflıklarıdır. Bununla birlikte, canlı görüntüleme için bu modelin amenability ve doğru anjiyojenik yanıtı quantitate yeteneği in vivo tümör anjiyogenezdüzenleyen hücresel süreçleri incelemek için benzersiz yararlı hale getirir.

Protocol

1. Mikroenjeksiyon İğnelerinin Hazırlanması Bir mikropipet çekmecesini açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın (Malzeme Tablosu’nda listelenen mikropipet çekmece modeli için kalibre edilmiş): Isı, 680; Çekme, 75; Hız, 40; Zaman, 55; Basınç: 530. Mikropipet çekmecesine borosilikat cam kılcal bir kılcal güvenli ve iki iğne yapmak için kılcal çekin. İstenildiği kadar iğne için tekrarlayın. 2. İmplantasyon için Hücre Kü…

Representative Results

6, 24 ve 48 hpi’de tek bir ksenograft görüntülenerek, farklı zaman noktalarındaki anjiyojenik yanıt Şekil 1A-C’degösterildiği gibi hesaplanabilir. En büyük anjiyojenik yanıt 24-48 h sonrası implantasyon arasında gözlenirken, en fazla greft vaskülarizasyonu 2 dpi civarında görülür (Şekil1A-C). Bir B16-F1 ksenogreft tipik bir anjiyojenik yanıt bir zaman atlamalı film 20.75 hp…

Discussion

Protokoldeki ilk kritik adım tümör hücrelerinin implantasyonudur. Hücrelerin, ksenogreftin embriyo ödem yapmadan embriyoya başarılı bir şekilde implant atmasını sağlayacak bir yere enjekte edilmesi esastır. Çok anterior bir enjeksiyon hücrelerin kalbe doğru hareket izin verebilir, kan dolaşımını engelleyen ve ödem yol açan, çok posterior bir enjeksiyon kötü implante ksenogreft neden olurken. Bir anterior enjeksiyon en iyi o enjekte olarak kalpten uzağa işaret ediyor, böylece arka yönde bir ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Auckland Üniversitesi zebra balığı tesisini ve Auckland Tıp Bilimleri Fakültesi Biyomedikal Görüntüleme Araştırma Birimi’ni yönettiği için Bay Alhad Mahagaonkar’a zaman atlamalı konfokal mikroskopi konusunda yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi proje hibesi (14/105), Yeni Zelanda Kraliyet Derneği Marsden Fonu Proje Hibesi (UOA1602) ve J.W.A.’ya verilen Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Air cylinder BOC 011G Xenotransplantation
B16-F1 cells ATCC Cell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) Corning 356235 Xenotransplantation
Borosillicate glass capillaries Warner Instruments G100T-4 OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection
Cell culture dish -35 mm diameter Thermofisher NZ NUN153066 Fish husbandry
Cell culture dish -100 mm diameter Sigma-Aldrich CLS430167-500EA Fish husbandry
Cell culture flask 75 cm2 In Vitro Technologies COR430641 Cell culture
CellTracker Green Invitrogen C2925 Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418 Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl

1.6 g KCl

5.8 g CaCl2·2H2O

9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH
In house [1] Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521 Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1000 μL VWR 732-1491 Used during multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 732-1489 Used during multiple steps
Filter tip 10 μL VWR 732-1487 Used during multiple steps
Fluorescence microscope Leica MZ16FA Preparation of embryos
FBS (NZ origin) Thermofisher Scientific 10091148 Cell culture
Gloves Any commercial brand Used during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer HawksleyVet AC1000 Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge Thermofisher Scientific 75004500 Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342 Thermofisher Scientific 62249 Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure Agarose Thermofisher Scientific 16520050 Imaging
Methycellulose Sigma-Aldrich 9004 67 5 Xenotransplantation
Methylene blue sigma-Aldrich M9140 Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries Eppendorf 5242956003 Xenotransplantation
Micropipettes Any commercial brand Used during multiple steps
Micropipette puller P 87 Sutter Instruments Xenotransplantation
Microscope cage incubator Okolab Time-lapse imaging
Microwave Any commercial brand Imaging
Mineral oil Sigma-Aldrich M3516 Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) – alpha Thermofisher Scientfic 12561056 Cell Culture
MPPI-2 Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation Xenotransplantation
Narishige micromanipulator Narishige Group Xenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope Nikon Imaging
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629 Fish husbandry
PBS Gibco 10010023 Cell culture
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122 Cell culture
S1 pipet filler Thermoscientific 9501 Cell culture
Serological stripette 10 mL Corning 4488 Cell culture
Serological stripette 25 mL Corning 4489 Cell culture
Serological stripette 5 mL Corning 4485 Cell culture
Serological stripette 2 mL Corning 4486 Cell culture
Terumo Needle 22 gauge Amtech SH 182 Fish husbandry
Tissue culture incubator Thermofisher Scientfic HeraCell 150i Cell culture
Tivozanib (AV951) AVEO Pharmaceuticals Drug treatment
Transfer pipette 3 mL Mediray RL200C Fish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25% ) Life Technologies T4049 Cell culture
Tweezers Fine Science Tools 11295-10 Fish husbandry
Volocity Software (v6.3) Improvision/Perkin Elmer Image analysis

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. 암 연구학. 70 (3), 1053-1062 (2010).
  3. Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
  4. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. 암 연구학. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  5. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
  6. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  7. Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
  8. Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
  9. Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
  10. Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
  11. Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  12. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  13. Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. 발생학. 248 (2), 307-318 (2002).
  15. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  16. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  17. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  18. Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
  19. Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
  20. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
  21. Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. 암 연구학. 66 (18), 9134-9142 (2006).
  22. Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
  23. Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
  24. Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
  25. Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. 암 연구학. 75 (20), 4272-4282 (2015).
  26. Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
  27. Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
  28. Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
  29. Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).

Play Video

Cite This Article
Britto, D. D., Hall, C. J., Astin, J. W. In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (150), e59849, doi:10.3791/59849 (2019).

View Video