Intravital Imaging af Intraepitelial lymfocytter i murine tyndtarmen
Summary
Vi beskriver en metode til at visualisere GFP-mærket γδ IELs ved hjælp af intravital billeddannelse af murine tyndtarmen ved inverteret spinning disk confokal mikroskopi. Denne teknik gør det muligt at spore levende celler i slimhinden i op til 4 timer og kan bruges til at undersøge en række af intestinal immun-epitheliale interaktioner.
Abstract
Intraepitelial lymfocytter, der udtrykker γδ T celle receptor (γδ IEL) spiller en central rolle i immun overvågning af tarm epitelet. På grund af manglen på en definitiv ligand for γδ T celle receptoren, er vores forståelse af reguleringen af γδ IEL aktivering og deres funktion in vivo fortsat begrænset. Dette nødvendiggør udvikling af alternative strategier til at afhøre signalerings veje involveret i reguleringen af γδ IEL funktion og reaktionsevne af disse celler til det lokale mikromiljø. Selv om γδ IELs er almindeligt forstået at begrænse patogenets translokation, har brugen af intravital Imaging været afgørende for forståelsen af den spatiale dynamik i IEL/epithelial interaktioner ved Steady-State og som reaktion på invasive patogener. Heri præsenterer vi en protokol til visualisering af IEL-migrerende adfærd i den lille intestinal slimhinde i en GFP γδ T-celle reporter mus ved hjælp af inverteret roterende disk confokal laser mikroskopi. Selv om den maksimale billeddannelses dybde af denne tilgang er begrænset i forhold til brugen af to-photon laser-scanning mikroskopi, spinning disk refleksionskonfokalmikroskopi laser mikroskopi giver fordelen ved høj hastighed billed erhvervelse med reduceret foto blegning og solskader. Ved hjælp af 4D billedanalyse software, T-celle overvågning adfærd og deres interaktioner med tilstødende celler kan analyseres efter eksperimentel manipulation for at give yderligere indsigt i IEL aktivering og funktion i tarmslimhinden.
Introduction
Intraepitelial lymfocytter (IEL) er placeret i tarm Epitelet, og findes både langs kælderen membran og mellem tilstødende epitelceller i det laterale intercellulære rum1. Der er omtrent en IEL for hver 5-10 epitelial celler; disse IELs tjene som Sentinels at give immun overvågning af den store flade af den intestinale epitelial barriere2. IELs, der udtrykker γδ T-celle receptoren (TCR), udgør op til 60% af den totale IEL-population i den murine tyndtarmen. Undersøgelser i γδ T-celle-mangel mus demonstrere en stort set beskyttende rolle af disse celler som reaktion på tarm skade, betændelse og infektion3,4,5. På trods af den generation af Tcrd knockout Mouse6, er vores forståelse af γδ IEL biologi fortsat begrænset på grund af det faktum, at ligander anerkendt af γδ TCR endnu ikke er identificeret7. Som et resultat, manglen på værktøjer til at studere denne cellepopulation har gjort det vanskeligt at undersøge den rolle, som γδ TCR aktivering og funktion under fysiologiske og patologiske betingelser. For at udfylde dette hul, har vi udviklet levende Imaging teknikker til at visualisere γδ IEL migrerende adfærd og interaktioner med tilstødende enterocytter som et middel til at give yderligere indsigt i γδ IEL funktion og lydhørhed over for eksterne stimuli in vivo.
I løbet af de sidste ti år har intravital Imaging væsentligt udvidet vores forståelse af de molekylære hændelser, der er involveret i flere facetter af intestinal biologi, herunder epitelial celle afgivelse8, regulering af epitel barriere funktion9 ,10, myeloid celle prøvetagning af luminale indhold11,12, og Host-Microbe interaktioner11,13,14,15,16 . I forbindelse med IEL-biologi har brugen af intravital mikroskopi kastet lys over den spatiale dynamik i IEL motilitet og de faktorer, der formidler deres overvågnings adfærd13,14,15, 16. det er Udviklingen af TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter mus, som etiketter γδ IELs af nukleare GFP udtryk17, afslørede, at Γδ iels er meget motile i epitelet og udviser en unik overvågning adfærd, der er lydhør over for mikrobielle infektion17,13,14. For nylig, en anden γδ T celle reporter mus blev udviklet (Tcrd-GDL) som udtrykker gfp i cytoplasma at tillade visualisering af hele cellen18. Lignende metode er blevet anvendt til at undersøge kravet om specifikke chemokine receptorer, såsom G protein-koblet receptor (GPCR)-18 og-55, på dynamikken i IEL motilitet19,20. I fravær af en celle specifik reporter blev fluorescerende konjugeret antistoffer mod CD8α anvendt til at visualisere og spore IEL motilitet in vivo19,20. Selv om to-photon Laserscanning mikroskopi er almindeligt anvendt til intravital Imaging, brugen af spinning disk refleksionskonfokalmikroskopi laser mikroskopi giver unikke fordele til at indfange høj hastighed og høj opløsning multi-kanal billeder med minimal baggrundsstøj. Denne teknologi er ideel til at belyse den spatiale dynamik i immun/epithelial interaktioner inden for det komplekse mikromiljø af tarmslimhinden. Desuden, gennem brug af forskellige transgene og/eller knockout musemodeller, disse undersøgelser kan give indsigt i den molekylære regulering af intestinal immun og/eller epitel cellefunktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af intravitale mikroskopi teknikker har givet en hidtil uset mulighed for at observere reorganiseringen af subcellulære strukturer8,9,22, celle celle interaktioner12, 25 og celle migrerendeadfærd 13,14,15,16,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grants, Busch Biomedical Grant (KLE). Vi takker Madeleine hu for hendes hjælp til at redigere manuskriptet og levere de data, der er vist i de repræsentative resultater.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
