이 문서에서는 대서양 연어의 미세 미네랄 가용성을 평가하기 위한 체계적인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 방법론은 생물학적 복잡성이 증가하는 도구와 모델을 포함한다: (1) 화학적 분화 분석, (2) 체외 용해도, (3) 세포주에서의 섭취 연구, (4) 생체 내 어류 연구.
식이 마이크로 미네랄의 가용성을 평가하는 것은 어종의 미네랄 영양에 큰 도전이다. 본 기사는 대서양연어(살모 살라)에서아연(Zn)의 가용성을 평가하기 위해 다양한 방법론을 결합한 체계적인 접근법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 대서양 연어 사료에 여러 Zn 화학 종이 존재할 수 있다는 점을 고려할 때, Zn 가용성이 사료에 존재하는 Zn 화학 종의 영향을 받는것으로 가설되었습니다. 따라서, 본 연구에서, 제1 프로토콜은 사료로부터 다른 Zn 화학종을 추출하고 크기 배제 크로마토그래피-유도 결합된 혈장 질량 분광법(SEC-ICP-MS) 방법으로 분석하는 방법에 관한 것이다. 그 후, 대서양 연어 사료에서 식이 Zn의 용해도를 평가하기 위해 체외 방법이 개발되었습니다. 세 번째 프로토콜은 레인보우 송어 창자 세포주 (RTgutGC)를 사용하여 물고기 장 상피 모델에서 Zn의 섭취에 Zn 화학 종 조성을 변경하는 영향을 연구하는 방법을 설명합니다. 함께, 체외 방법에서 사실 인정은 대서양 연어 사료에 보충된 Zn의 무기 및 유기 근원의 명백한 가용성을 검토하는 생체 내 연구 결과와 비교되었습니다. 그 결과, 여러 Zn 화학 종은 사료에서 발견될 수 있으며 유기 Zn 소스의 효율성은 Zn을 chelate하는 데 사용되는 아미노산 리간드에 매우 의존한다는 것을 보여주었습니다. 체외 방법의 사실 인정은 생체 내 연구 결과의 그 결과와 더 적은 상관관계가 있었습니다. 그럼에도 불구하고 이 문서에서 설명된 체외 프로토콜은 Zn 가용성 및 생선 사료의 평가에 관한 중요한 정보를 제공했습니다.
생선 식사와 생선 기름은 전통적으로 대서양 연어 사료에 사용되었습니다. 그러나, 이러한 성분은 점점 식물 성 성분에 의해 대체 되고있다1. 앞서 언급한 사료 조성의 변화로 인해 식이 가용성이 낮아지고 대서양 연어 사료, 특히 아연(Zn)2의미네랄 가용성 을 개선할 필요성이 증가했습니다. 감소된 가용성은 Zn 수준, Zn 화학 종 또는/및 사료 매트릭스에 존재하는 반영양 인자의 변화의 결과일 수 있습니다. 이 시나리오에서, 일반적으로 ‘유기 소스’로 간주 첨가제의 새로운 배열은 물고기에 식이 미네랄의 더 나은 사용 가능한 소스 되 고의 잠재력으로 등장 했다. 따라서 미네랄과 물고기에 대한 공급원의 가용성을 지배하는 근본적인 화학 및 생리학을 이해하는 것이 중요합니다. 아연은 모든 살아있는 유기체3에필수적인 미량 원소입니다. 신호 분자로서 Zn의 역할은 물고기4의세포세포 및 세포 내 수준에서 모두 기술되었다. 대서양 연어에서, Zn 결핍은 골격 이상및 다양한 Zn 금속효소의감소 된 활동과 연관되어있다5,6.
이 연구는 다양한 화학 적 및 생물학적 복잡성의 네 가지 구획으로 분류하여 Zn 가용성을 이해하는 체계적인 접근 방식을 설명합니다. 관련 방법은 도 1에서볼 수 있듯이 4개의 섹션으로 설명되어 있습니다 : (1) 크기 배제 크로마토그래피-유도 결합 된 혈장 질량 분광법 (SEC-ICP-MS) 방법을 사용하여 대서양 연어 사료의 수용성 분획에서 Zn 화학 종의 평가7; (2) 대서양 연어 사료에서 보충 Zn의 체외 용해도; (3) 시험장 모델(RTgutGC)8에의한 Zn 화학종 섭취평가; 및 (4) 대서양 연어에서 Zn의 명백한 가용성(살모 살라)9. 양식 물고기 종에 영양 관심의 다른 미네랄 (예를 들어, 망간, 셀레늄, 구리)에 대해 유사한 프로토콜을 개발할 수 있습니다.
Zn의 장 흡수는 Zn 종13의화학적 형태에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 이와 관련하여, 이 문서에 설명된 프로토콜의 사용은 대서양 연어에서 Zn의 ‘가용성’의 근본적인 화학 적 및 생물학적 측면에 대한 순차적 연구를 허용했습니다.
이 연구는 Zn 표본 분석 방법의 사용을 보고했다. SEC-ICP-MS 방법은 대서양 연어 사료의 수용성 분획에 존재하는 Zn 화학 종의 분자량에 관한 정성적 데이터를 제공했습니다. 이는 분자량 교정 기준(즉, 티로글로불린(660kDa), Zn/Cu 수퍼옥사이드 디스무타스(32kDa), 미오글로빈(17kDa), 비타민 B12(1.36kDa)의 보존 시간을 비교하여 달성하였다. Zn 표본 분석에서 발견된 과제는 분석 표준의 부족으로 인해 알려지지 않은 Zn 화학 종의 식별이었습니다. SEC에서 분자의 분리는 고정 된 단계에서 기공에 비해 자신의 크기를 기반으로합니다. 원칙적으로, 더 큰 분자는 더 빨리 여행할 것이고, 먼저 용례하고, 더 작은 분자는 나중에14를보례하면서 느리게 여행할 것입니다. 따라서, 피크를 포함하는 각 Zn은 유사한 분자량15를가진 몇몇 화합물을 포함할 수 있습니다. 이것은 또한 알려지지 않은 Zn 화학 종을 확인하는 도전에 기여합니다. 더욱이, 몇몇 온화한 추출 조건은 Zn의 추출을 위해 시험되었습니다. 추출된 Zn은 낮았습니다(~10%). 온화한 추출 조건은 Zn 화학 종을 그대로 유지하기 위해 적용되었지만 이것은 추출 효율7을손상시킬 수 있습니다.
시험관 내 용해도 분석에서, 보충 된 Zn의 용해도 (라디오 동위 원소 65ZnCl2)아미노산, 특히 히스티딘 및 라이신, Zn의 용해도 증가 표시(그림 5). 시뮬레이션된 위장 조건하에서 체외 용해도 분석법에 직접 사료 샘플을 사용하는 것은 Zn 분화의 변화가 pH의존16이라는지식을 기반으로 한다. 그러나, 기관의 시작 부분에 산성 조건, 돌이킬 수 있는 수 있는 분광기에 있는 몇몇 변경귀착될 수 있습니다 (예를 들면, ZnO-> ZnCl2,위장에 있는 산성 조건하에서 HCl의 존재). 그럼에도 불구 하 고, Zn 소스는 ZnSO4 그리고 매체에서 아미노산에 의해 향상 된 용해도. 다음 질문에 대한 질문은 증가된 용해도가 가용성으로 변환될 수 있다는 것이었습니다. RTgutGC 장 세포주는이 질문을 연구하는 데 사용되었다. 동물에서 미네랄 영양의 맥락에서, 용어 ‘가용성’ 정의 하기 어렵고 동물에 비해 세포에서 차별화 할 수 있습니다 (생체 내). 따라서, ‘섭취’라는 용어는 장 세포주사용으로 시험관 내 평가에 올 때 사용되었다. 세포주는 동물의 미네랄 가용성을 제어하는 복잡한 규제 과정의 일부인 장 상피에서 Zn 섭취 메커니즘에 대한 유용한 정보를 제공했습니다. RTgutGC 세포는 아미노산의 존재에 Zn의 apical upup에 대 한 더 나은 용량을 유도 (즉, 메티오닌; 그림 6). 그러나, 생체 내 명백한 가용성크게 대서양 연어에서 무기와 유기 Zn 소스 사이 차이가 없었다. 생체 내 가용성 연구에서 Zn 소스 비교는 대서양 연어의 알려진 Zn 요구 사항을 훨씬 능가 하는 식이 Zn 수준에서 만들어졌다17,총 Zn 농도 150 mg/kg 피드. 사용 가능 여부의 차이는 동물이 포화상태에 도달하기 전에 테스트된 식이 수준이 선형 동적 범위에서 떨어질 때 더 잘 시각화됩니다. 본 생체 내 연구에서, 대서양 연어는 잘 포화 된 소스 간의 Zn 흡수의 차이를 관찰 할 수있다.
요약하자면, 첫 번째 방법은 대서양 연어 사료의 가용성 분획에서 발견되는 다른 Zn 화학 종에 관한 질적 정보를 제공했습니다. 두 번째 방법은, 보충 된 Zn의 체외 용해도는 아미노산 리간드의 존재에서 향상되었다; 세 번째 방법은 아미노산에 의한 용해도가 개선되어 장 상피에서 섭취를 향상시킬 수 있음을 확인했습니다. 반대로, 네 번째 방법은 무기 또는 유기농 공급원에서 대서양 연어에 이르기까지 Zn의 가용성에 있는 차이를 찾아내지 못했습니다. 결론을 내리기 위해 생체 내 결과와 일치하지는 않지만 체외 프로토콜은 Zn 가용성의 다양한 구성 요소를 이해하는 흥미로운 통찰력을 제공했습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 노르웨이 연구 위원회가 지원하는 프로젝트 APREMIA (대서양 연어의 미네랄의 명백한 가용성 및 요구 사항, 244490 호 부여)에 따라 수행되었습니다.
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |