Denne artikkelen forklarer i detalj en systematisk tilnærming for å vurdere mikromineraltilgjengelighet i atlantisk laks. Metodikken omfatter verktøy og modeller med økende biologisk kompleksitet: (1) kjemisk spesieringsanalyse, (2) in vitro løselighet, (3) opptaksstudier i cellelinjer og (4) in vivo fiskestudier.
Å vurdere tilgjengeligheten av mikromineraler i kostholdet er en stor utfordring i mineralernæring av fiskearter. Denne artikkelen tar sikte på å beskrive en systematisk tilnærming som kombinerer ulike metoder for å vurdere tilgjengeligheten av sink (Zn) i atlantisk laks (Salmo salar). Tatt i betraktning at flere Zn kjemiske arter kan være til stede i en atlantisk laksefôr, ble det hypoteset at Zn-tilgjengeligheten påvirkes av Zn kjemiske arter som er tilstede i fôret. I denne studien handler den første protokollen om hvordan man trekker ut de forskjellige Zn-kjemiske artene fra fôret og analyserer dem ved hjelp av en størrelseseksklusjonskromatografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode. Deretter ble det utviklet en in vitro-metode for å evaluere løseligheten av diett Zn i atlantisk laksefôr. Den tredje protokollen beskriver metoden for å studere effekten av å endre Zn kjemisk artsammensetning på Zns opptak i en fisk intestinal epitelial modell ved hjelp av en regnbueørret tarmcellelinje (RTgutGC). Sammen ble funnene fra in vitro-metodene sammenlignet med en in vivo-studie som undersøkte den tilsynelatende tilgjengeligheten av uorganiske og organiske kilder til Zn supplert med atlantisk laksefôr. Resultatene viste at flere Zn kjemiske arter finnes i fôr og effektiviteten til en organisk Zn-kilde avhenger veldig mye av aminosyreligaen som brukes til å chelate Zn. Funnene i in vitro-metodene hadde mindre sammenheng med utfallet av in vivo-studien. Likevel ga in vitro-protokoller beskrevet i denne artikkelen viktig informasjon om Zn-tilgjengelighet og dens vurdering i fiskefôr.
Fiskemel og fiskeolje ble tradisjonelt brukt i atlantisk laksefôr. Imidlertid blir disse ingrediensene i økende grad erstattet av plantebaserte ingredienser1. Det nevnte skiftet i fôrsammensetningen har resultert i lav kostholdstilgjengelighet og økt behov for å forbedre mineraltilgjengeligheten i atlantisk laksefôr, spesielt sink (Zn)2. Den reduserte tilgjengeligheten kan være et resultat av en endring i Zn-nivået, Zn kjemiske arter eller / og antinæringsfaktorer som finnes i fôrmatrisen. I dette scenariet har et nytt utvalg av tilsetningsstoffer generisk betraktet som “organiske kilder” dukket opp med potensial for å være en bedre tilgjengelig kilde til diettmineraler til fisk. Derfor er det viktig å forstå grunnleggende kjemi og fysiologi som styrer tilgjengeligheten av mineraler og deres kilder til fisk. Sink er et viktig sporelement for alle levende organismer3. Zns rolle som signalmolekyl er beskrevet både på paracellulært og intracellulært nivå i fisk4. I atlantisk laks har Zn-mangel vært forbundet med skjelettavvik og redusert aktivitet av ulike Zn metalloenzymer5,6.
Denne studien beskriver en systematisk tilnærming for å forstå Zn-tilgjengelighet ved å kategorisere den i fire forskjellige rom med variert kjemisk og biologisk kompleksitet. Metodene som er involvert er beskrevet i fire seksjoner, som det fremgår av figur 1: (1) evaluering av Zn kjemiske arter i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr ved hjelp av en størrelseseksklusjon kromatografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode7; (2) in vitro løselighet av supplert Zn i atlantisk laksefôr; (3) evaluering Zn kjemiske arter opptak ved in vitro intestinal modell (RTgutGC)8; og (4) tilsynelatende tilgjengelighet av Zn i atlantisk laks (Salmo salar)9. Lignende protokoller kan utvikles for andre mineraler (f.eks. mangan, selen, kobber) av ernæringsmessig interesse for oppdrettsfiskarter.
Tarmabsorpsjonen av Zn ser ut til å være påvirket av den kjemiske formen til Zn-artene13. I denne forbindelse tillot bruken av protokollene beskrevet i denne artikkelen den sekvensielt studiet av de kjemiske og biologiske aspektene som ligger til grunn for “tilgjengeligheten” av Zn i atlantisk laks.
Denne studien rapporterte bruk av en Zn-spesieringsanalysemetode. SEC-ICP-MS-metoden ga kvalitative data om molekylvekten til Zn kjemiske arter tilstede i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr. Dette ble oppnådd ved sammenligning av oppbevaringstidene for molekylvektkalibreringsstandardene (dvs. tyroglobulin (660 kDa), Zn / Cu superoksid dismutase (32 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B12 (1,36 kDa)) med oppbevaringstidene til Zn som inneholder topper. En utfordring som ble funnet i Zn-spesieringsanalysen var identifiseringen av de ukjente Zn-kjemiske artene på grunn av mangel på analytiske standarder. I SEC er separasjonen av molekylene basert på deres størrelser i forhold til porene i den stasjonære fasen. I prinsippet vil større molekyler reise raskere, eluting først, og mindre molekyler vil reise langsommere, eluting senere14. Følgelig kan hver Zn som inneholder topp inneholde flere forbindelser med lignendemolekylvekt 15. Dette bidrar også til utfordringen med å identifisere ukjente Zn kjemiske arter. Videre ble flere milde utvinningsforhold testet for utvinning av Zn. Den ekstraherte Zn var lav (~ 10%). Milde utvinningsforhold ble brukt for å holde Zn kjemiske arter intakte, men dette kan ha kompromittert utvinningseffektiviteten7.
I in vitro løselighetsanalysen indikerte løseligheten til supplert Zn (som radioisotop 65ZnCl2) at aminosyrene, spesielt histidin og lysin, økte oppløseligheten til Zn (figur 5). Bruk av fôrprøver direkte for in vitro løselighetsanalyser under simulerte gastrointestinale tilstander er basert på kunnskapen om at endring i Zn-spesiering er pH-avhengig16. Sure forhold i begynnelsen av GI-kanalen kan imidlertid føre til en viss endring i spesieringen som kan være irreversibel (f.eks. ZnO -> ZnCl2, i nærvær av HCl under sure forhold i magen). Likevel er Zn-kilden som brukes her ZnSO4 og løseligheten som ble forbedret av aminosyrer i mediet. Det neste spørsmålet som skulle besvares var, kan den økte løseligheten oversettes til tilgjengelighet? RTgutGC tarmcellelinjen ble brukt til å studere dette spørsmålet. I sammenheng med mineralernæring hos dyr er begrepet “tilgjengelighet” vanskelig å definere og kan reguleres differensialt i cellene (in vitro) sammenlignet med et dyr (in vivo). Derfor ble begrepet ‘opptak’ brukt når det gjaldt in vitro-evalueringen ved hjelp av tarmcellelinjen. Cellelinjen ga nyttig informasjon om Zn-opptaksmekanismene ved tarmepitelet som er en del av den komplekse regulatoriske prosessen som styrer mineraltilgjengelighet hos dyr. RTgutGC-cellene fremkalte en bedre kapasitet for apikalt opptak av Sn i nærvær av en aminosyre (dvs. metionin; Figur 6). Den tilsynelatende tilgjengeligheten i vivo var imidlertid ikke signifikant forskjellig mellom uorganiske og organiske Zn-kilder i atlantisk laks. I in vivo tilgjengelighetsstudien ble Zn-kildesammenligningen gjort på diett Zn-nivåer som godt overgikk de kjente Zn-kravene til atlantisk laks17, total Zn-konsentrasjon på 150 mg / kg fôr. Forskjellene i tilgjengelighet visualiseres bedre når de testede diettnivåene faller i det lineære dynamiske området før dyret når metning. I den nåværende in vivo-studien er det mulig at atlantisk laks var godt mettet for å observere forskjell i Zn-absorpsjon mellom brukte kilder.
Oppsummert ga den første metoden kvalitativ informasjon om forskjellige Zn kjemiske arter som finnes i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr; Den andre metoden, in vitro løselighet av supplert Zn ble forbedret i nærvær av aminosyre ligander; den tredje metoden bekreftet at forbedret løselighet av aminosyrer kan forbedre opptaket ved intestinal epitel; På den annen side klarte ikke den fjerde metoden å finne forskjeller i tilgjengeligheten av Zn fra uorganisk eller organisk kilde til atlantisk laks. For å konkludere, men ikke i tråd med in vivo-funnene, ga in vitro-protokollene interessant innsikt i å forstå de forskjellige komponentene i Zn-tilgjengeligheten.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble utført under prosjektet APREMIA (Tilsynelatende tilgjengelighet og krav til mineraler i atlantisk laks, tilskudd nr. 244490) finansiert av Norges forskningsråd.
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |