Denne protokol fokuserer på identifikation af proteiner, der binder sig til inositol phosphater eller phosphoinositides. Det bruger affinitets kromatografi med biotinylerede inositol phosphater eller phosphoinositides, der er immobiliseret via streptavidin til agopstået eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller phosphoinositide binding proteiner er identificeret ved Western blotting eller massespektrometri.
Inositol phosphater og phosphoinositides regulere flere cellulære processer i eukaryoter, herunder genekspression, vesikelprotein handel, signaltransduktion, metabolisme, og udvikling. Disse metabolitter udfører denne regulerings aktivitet ved at binde sig til proteiner og derved ændre protein konformationen, katalytisk aktivitet og/eller interaktioner. Den beskrevne metode bruger affinitets kromatografi koblet til massespektrometri eller Western blotting til at identificere proteiner, der interagerer med inositol phosphater eller phosphoinositides. Inositol phosphater eller phosphoinositides er kemisk mærket med biotin, som derefter fanges via streptavidin konjugeret til agopstået eller magnetiske perler. Proteiner isoleres ved deres affinitet af binding til metabolitten, derefter elueres og identificeres ved massespektrometri eller Western blotting. Metoden har en enkel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, liposome-fri, og tilpasselig, støtte analyse af protein og metabolit interaktion med præcision. Denne fremgangsmåde kan anvendes i label-fri eller i aminosyre-mærkede kvantitative massespektrometri metoder til at identificere protein-metabolit interaktioner i komplekse biologiske prøver eller ved hjælp af rensede proteiner. Denne protokol er optimeret til analyse af proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til beslægtede protozoer parasitter, gær eller pattedyrceller.
Inositol phosphater (IPS) og phosphoinositides (pi’er) spiller en central rolle i eukaryote biologi gennem regulering af cellulære processer såsom kontrol af genekspression1,2,3, vesikle handel 4, signaltransduktion5,6, metabolisme7,8,9, og udvikling8,10. Den regulerende funktion af disse metabolitter skyldes deres evne til at interagere med proteiner og dermed regulere protein funktion. Ved binding af proteiner kan IPs og Pi’er ændre protein konformationen11, katalytisk aktivitet12eller interaktioner13 og dermed påvirke cellulær funktion. IPS og pi’er distribueres i flere subcellulære rum, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske reticulum16,17, plasma membran1 og cytosol18, enten associeret med proteiner3,19 eller med RNAs20.
Spaltningen af membranen-associeret PI (4,5) P2 ved fosfolipase C resulterer i frigivelse af ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleres eller defosforyleres ved henholdsvis IP-kinaser og fosfataser. IPs er opløselige molekyler, der kan binde sig til proteiner og udøve regulerende funktioner. For eksempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en anden budbringer ved binding til IP3 receptorer, som inducerer receptoren konformationsmæssige ændringer og dermed frigivelse af ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder sig til Histon deacetylase-komplekset og regulerer protein kompleks montage og aktivitet13. Andre eksempler på IPS reguleringsfunktion omfatter kontrol af kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkriptionen1,2,3 . I modsætning hertil er pi’er ofte forbundet med rekruttering af proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en ny ejendom af pi’er er evnen til at associere med proteiner i et ikke-membranøs miljø3,15,19,26. Dette er tilfældet med den nukleare receptor akut faktor, som transkriptional kontrolfunktion er reguleret af PI (3, 4, 5) P319, og poly-A polymerase hvilken enzymatisk aktivitet er reguleret af nukleare PI (4,5) P226. En regulerende rolle for IPS og pi’er er blevet vist i mange organismer, herunder gær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Af betydning er disse metabolitters rolle i trypanosomer, som afveg tidligt fra den eukaryotiske afstamning. Disse metabolitter spiller en væsentlig rolle i Trypanosoma brucei transkriptional Control1,3, Development8, organelle Biogenese og protein Traffic29,30 , 31 , 32, og er også involveret i at kontrollere udvikling og infektion i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 , 37. derfor kan forståelse af IPS ‘ og pi’s rolle i trypanosomer bidrage til at belyse nye biologiske funktioner for disse molekyler og identificere nye narkotikaprækursorer.
Specificiteten af protein og IP eller PI binding afhænger af protein interagere domæner og fosforylering tilstand af inositol13,38, selv om interaktioner med lipiddelen af pi’er også forekommer19. Variationen af IPs og Pi’er og deres modificerende kinaser og fosfataser giver en fleksibel cellulær mekanisme til kontrol af protein funktion, som påvirkes af metabolitten tilgængelighed og overflod, fosforylering tilstand af inositol, og protein affinitet af interaktion1,3,13,38. Selv om nogle protein domæner er velkarakteriserede39,40,41, fx pleckstrin homologi Domain42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domæner43 ,44,45, nogle proteiner interagerer med IPS eller pi’er af mekanismer, der forbliver ukendte. For eksempel mangler den repressor-aktivator protein 1 (RAP1) af T. brucei CANONICAL pi-binding domæner, men INTERAGERER med PI (3, 4, 5) P3 og kontrol transkriptionen af gener involveret i antigen variation3. Affinitets kromatografi og massespektrometri-analyse af IP-eller PI-interagerende proteiner fra trypanosome, gær eller pattedyrsceller identificerede flere proteiner uden kendte IP-eller PI-bindings domæner8,46, 47. dataene tyder på yderligere ukarakteriserede protein domæner, der binder sig til disse metabolitter. Derfor, identifikation af proteiner, der interagerer med IPs eller Pi’er kan afsløre nye mekanismer af protein-metabolit interaktion og nye cellulære regulerende funktioner for disse små molekyler.
Den beskrevne metode beskæftiger sig med affinitets kromatografi koblet til Western blotting eller massespektrometri for at identificere proteiner, der binder sig til IPs eller Pi’er. Det bruger biotinylerede IPs eller Pi’er, der enten er tværbundet til streptavidin konjugeret til aganerede perler eller alternativt, fanget via streptavidin-konjugeret magnetiske perler (figur 1). Metoden giver en enkel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, liposome-fri og er egnet til påvisning af binding af proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan anvendes i etiket-fri8,46 eller koblet til aminosyre-mærket kvantitativ massespektrometri47 til at identificere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metode et alternativ til de få metoder til rådighed til at studere samspillet mellem IPs eller Pi’er med cellulære proteiner og vil hjælpe med at forstå den regulerende funktion af disse metabolitter i trypanosomes og måske andre eukaryoter.
Identifikationen af proteiner, der binder sig til IPs eller Pi’er, er afgørende for at forstå disse metabolitters cellulære funktion. Affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri giver mulighed for at identificere IP-eller PI-interagerende proteiner og dermed få indsigt i deres reguleringsfunktion. IPS eller pi’er, der er kemisk mærkede [f. eks. ins (1, 4, 5) P3 kemisk forbundet med biotin] og tværbundet til aganerede perler via streptavidin eller fanget af streptavidin magnetiske perler …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Canadas naturvidenskabs-og ingeniør Forskningsråd (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch supplement til Early Career forskere (DGECR-2019-00081) og af McGill University.
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvent |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | Inorganic salt |
Centrifuge Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrifuge for large volumes (e.g., 1L) |
Centrifuge botles | Sigma-Aldrich | B1408 | Bottles for centrifugation of 1L of culture |
Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | Affinity chromatography reagent – control |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar, Added in PBS to keep cells viable |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Reducing agent |
Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads for binding to biotin ligands |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitors |
Electrophoresis running buffer | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning Life Sciences | 430052 | To centrifuge 10 mL cultures |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 106526 | Acid |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Amino acid |
HMI-9 cell culture medium | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms |
Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity chromatography reagent |
Instant Nonfat Dry Milk | Thomas Scientific | C837M64 | Blocking reagent for Western blotting |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | For binding assays |
LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Low protein binding tubes for mass spectrometry |
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergent |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Physiological buffer |
Peroxidase substrate for chemiluminescence | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrate for Western bloting detection of proteins |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Phosphatase inhibitors |
PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Affinity chromatography reagent |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Affinity chromatography reagent |
PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | For Western blotting |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL) |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergent |
Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
SpeedVac Vacuum Concentrators | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Sample concentration (e.g., for mass spectrometry) |
T175 flasks for cell culture | ThermoFisher Scientific | 159910 | To grow 50 mL T. brucei culture |
Trypsin, Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | Trypsin for protein digestion |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | Denaturing reagent |
Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | For mixing reactions |
Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol |
Whatman 3 mm paper | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Reducing agent |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Protein loading buffer |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for protein electrophoresis |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Protein loading buffer |