JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Abstract

Inositol fosfaten en fosfoinositides reguleren verschillende cellulaire processen in eukaryoten, met inbegrip van genexpressie, blaasje handel, signaaltransductie, metabolisme, en ontwikkeling. Deze metabolieten voeren deze regelgevende activiteit uit door binding aan eiwitten, waardoor het veranderen van eiwit conformatie, katalytische activiteit, en/of interacties. De hier beschreven methode maakt gebruik van affiniteits chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie of westerse blotting om te identificeren van eiwitten die interactie met inositol fosfaten of fosfoinositides. Inositol fosfaten of fosfoinositides zijn chemisch gelabeld met biotine, die vervolgens wordt gevangen via streptavidine geconjugeerd aan agarose of magnetische kralen. Eiwitten worden geïsoleerd door hun affiniteit van binding aan de metaboliet, vervolgens geellueerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie of westerse blotting. De methode heeft een eenvoudige workflow die gevoelig, niet-radioactieve, Liposome-vrij, en aanpasbare, ondersteuning van de analyse van de interactie van eiwitten en metaboliet met precisie. Deze aanpak kan worden gebruikt in etiket vrije of in aminozuur-gelabelde kwantitatieve massaspectrometrie methoden om interacties van eiwit metaboliet in complexe biologische monsters of met behulp van gezuiverde eiwitten te identificeren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van eiwitten van Trypanosoma brucei, maar kan worden aangepast aan verwante protozoaanse parasieten, gist of zoogdiercellen.

Introduction

Inositol fosfaten (IPS) en fosfoinositides (pi’s) spelen een centrale rol in de eukaryote biologie door de regulering van cellulaire processen zoals de beheersing van genexpressie1,2,3, blaasje handel 4, signaaltransductie5,6, metabolisme7,8,9, en ontwikkeling8,10. De regelgevende functie van deze metabolieten is het gevolg van hun vermogen om te interageren met eiwitten en zo de eiwit functie te reguleren. Na binding door eiwitten, IPs en Pi’s kunnen eiwit conformatie wijzigen11, katalytische activiteit12, of interacties13 en dus beïnvloeden cellulaire functie. IPS en pi’s worden verdeeld in meerdere subcellulaire compartimenten, zoals Nucleus2,3,14,15, endoplasmatisch reticulum16,17, plasma membraan1 en cytosol18, ofwel geassocieerd met eiwitten3,19 of met RNAS20.

Het decolleté van de membraan-geassocieerde PI (4, 5) P2 door fosfolipase C resulteert in de afgifte van ins (1, 4, 5) P3, die kan worden gefosforyleerd of gedefosforyleerd door respectievelijk IP-kinasen en fosfatasen. IPs zijn oplosbare moleculen die kunnen binden aan eiwitten en regelgevende functies uitoefenen. Bijvoorbeeld, ins (1, 4, 5) P3 in metazoan kan fungeren als een tweede boodschapper door binding aan IP3 receptoren, die receptor conformationale veranderingen induceert en dus vrijlating van CA2 + van intracellulaire winkels11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 bindt aan het histon deacetylase complex en reguleert het eiwit complex assemblage-en activiteit13. Andere voorbeelden van IPS regulerende functie zijn onder andere de controle van chromatine organisatie21, RNA transport22,23, RNA Editing24, en transcriptie1,2,3 . In tegenstelling, worden pi’s vaak geassocieerd met de werving van eiwitten aan het plasma membraan of organel membranen25. Een opkomende eigenschap van pi’s is echter het vermogen om te associëren met eiwitten in een niet-membraneuze omgeving3,15,19,26. Dit is het geval van de nucleaire receptor steroidogenic factor, welke transcriptionele controlefunctie wordt gereguleerd door PI (3, 4, 5) P319, en poly-A polymerase welke enzymatische activiteit wordt gereguleerd door Nuclear PI (4, 5) P226. Een regelgevende rol voor IPS en pi’s is aangetoond in vele organismen, waaronder gist22,27, zoogdiercellen19,23, Drosophila10 en Worms28. Van betekenis is de rol van deze metabolieten in trypanosomes, die vroeg van de eukaryotische afstamming afwijken. Deze metabolieten spelen een essentiële rol in Trypanosoma brucei Transcriptionele controle1,3, ontwikkeling8, Organel biogenese en eiwit verkeer29,30 , 31 , 32, en zijn ook betrokken bij het beheersen van de ontwikkeling en infectie in de pathogenen T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 en Plasmodium 5 , 37. Vandaar dat het begrijpen van de rol van IPS en pi’s in trypanosomen kan helpen om nieuwe biologische functie voor deze moleculen te verhelden en om te bepalen nieuwe geneesmiddel doelen.

De specificiteit van eiwitten en IP of pi binding hangt af van de eiwit-interactie domeinen en de fosforylatie toestand van de inositol13,38, hoewel interacties met het lipide deel van pi’s ook voorkomt19. De verscheidenheid van IPs en Pi’s en hun modificerende kinases en fosfatasen biedt een flexibele cellulaire mechanisme voor het beheersen van de eiwit functie die wordt beïnvloed door de beschikbaarheid van de metaboliet en overvloed, de fosforylering staat van de inositol, en eiwitten affiniteit van interactie1,3,13,38. Hoewel sommige eiwit domeinen goed gekarakteriseerd zijn39,40,41, bijvoorbeeld, pleckstrin homologie domein42 en SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domeinen43 ,44,45, sommige eiwitten interactie met IPS of pi’s door mechanismen die onbekend blijven. Bijvoorbeeld, de repressor-Activator proteïne 1 (RAP1) van T. brucei mist canonieke Pi-bindende domeinen maar communiceert met PI (3, 4, 5) P3 en controle transcriptie van genen die betrokken zijn bij antigene variatie3. Affiniteits chromatografie en massaspectrometrie analyse van IP-of pi-interactie eiwitten van trypanosome, gist of zoogdiercellen identificeerden verschillende eiwitten zonder bekende IP-of pi-bindende domeinen8,46, 47. de gegevens suggereren aanvullende niet-gekarakteriseerde proteïne-domeinen die aan deze metabolieten binden. Vandaar dat de identificatie van eiwitten die interageren met IPs of Pi’s nieuwe mechanismen van eiwit-metaboliet interactie en nieuwe cellulaire regelgevende functies voor deze kleine moleculen kunnen onthullen.

De hier beschreven methode maakt gebruik van affiniteits chromatografie gekoppeld aan westerse blotting of massaspectrometrie om eiwitten te identificeren die aan IPs of Pi’s binden. Het maakt gebruik van biotinyleerd IPS of pi’s die ofwel kruislings gekoppeld aan streptavidine geconjugeerd aan agarose kralen of als alternatief, gevangen via streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen (Figuur 1). De methode biedt een eenvoudige workflow die gevoelig, niet-radioactief, liposoom vrij en is geschikt voor het opsporen van de binding van eiwitten uit cel lysaten of gezuiverde eiwitten3 (Figuur 2). De methode kan worden gebruikt in etiket vrij8,46 of gekoppeld aan aminozuur-gelabelde kwantitatieve massaspectrometrie47 om IP-of pi-bindende eiwitten van complexe biologische monsters te identificeren. Vandaar, deze methode is een alternatief voor de weinige methoden die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de interactie van IPS of pi’s met cellulaire eiwitten en zal helpen bij het begrijpen van de regelgevende functie van deze metabolieten in trypanosomen en misschien andere eukaryoten.

Protocol

1. analyse van IP-of PI-bindende eiwitten door affiniteits chromatografie en Western blotting Celgroei, lysis en affiniteits chromatografie Groeien T. brucei cellen naar mid-log fase en bewaken cel levensvatbaarheid en dichtheid. Een totaal van 5,0 x 107 cellen is voldoende voor één bindende assay. Voor bloedstroom vormen, kweekcellen in HMI-9 Media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C en 5% CO2. Houd de celdichtheid tussen 8,0…

Representative Results

Analyse van RAP1 en PI (3, 4, 5) P3-interactie door affiniteits chromatografie en Western blottingDit voorbeeld illustreert de toepassing van deze methode voor het analyseren van de binding van pi’s door RAP1 van t. brucei lysaat of door recombinant t. brucei RAP1 eiwit. Lysates van T. brucei bloedbaan vormen die Express gemaggljutininovuju (ha)-tagged RAP1 werden gebruikt in bindende assays. RAP1 is een eiwit dat betrokken is bij Transcriptionele controle van variant opper…

Discussion

De identificatie van eiwitten die binden aan IPs of Pi’s is van cruciaal belang om de cellulaire functie van deze metabolieten te begrijpen. Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie biedt de mogelijkheid om IP-of PI-interacties te identificeren en zodoende inzicht te krijgen in hun regelgevende functie. IPS of pi’s die chemisch zijn gelabeld [bv., ins (1, 4, 5) P3 die chemisch zijn gekoppeld aan biotine] en gecrosslinkt naar agarose-parels via streptavidine of gevangen door streptavidin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch supplement voor vroege loopbaan onderzoekers (DGECR-2019-00081) en door McGill University.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay
check_url/kr/59865?article_type=t&slug=identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image