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생화학

Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Questo protocollo si concentra sull’identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Abstract

Fosfati inositoli e fosfoinossidi regolano diversi processi cellulari negli eucarioti, tra cui l’espressione genica, il traffico di vescicle, la trasduzione del segnale, il metabolismo e lo sviluppo. Questi metaboliti svolgono questa attività regolatrice legandosi alle proteine, cambiando così la conformazione proteica, l’attività catalitica e/o le interazioni. Il metodo qui descritto utilizza la cromatografia di affinità accoppiata alla spettrometria di massa o al gonfiore occidentale per identificare le proteine che interagiscono con fosfati inositoli o fosfoinossidi. I fosfati inositoli o fosforosati sono etichettati chimicamente con biotina, che viene poi catturata tramite streptavidina coniugata ad agarose o perline magnetiche. Le proteine sono isolate dalla loro affinità di legame con il metabolita, poi eluite e identificate da spettrometria di massa o gonfiore occidentale. Il metodo ha un flusso di lavoro semplice, non radioattivo, privo di liposomi e personalizzabile, che supporta con precisione l’analisi dell’interazione tra proteine e metaboliti. Questo approccio può essere utilizzato in metodi di spettrometria di massa quantitativa senza etichetta o con elementi aminoacidi per identificare le interazioni proteina-metabolita in campioni biologici complessi o utilizzando proteine purificate. Questo protocollo è ottimizzato per l’analisi delle proteine di Trypanosoma brucei, ma può essere adattato ai relativi parassiti protozoi, lieviti o cellule mammiferi.

Introduction

I fosfati inositoli (IP) e le fosfoinosti (PI) svolgono un ruolo centrale nella biologia degli eucarioti attraverso la regolazione dei processi cellulari come il controllo dell’espressione genica1,2,3, il traffico di vescicocchi 4, trasduzione del segnale5,6, metabolismo7,8,9, e lo sviluppo8,10. La funzione regolatoria di questi metaboliti deriva dalla loro capacità di interagire con le proteine e quindi regolare la funzione proteica. Al momento del legame da parte delle proteine, IP e PI possono alterare la conformazione proteica11, l’attività catalitica12o le interazioni13 e quindi influenzare la funzione cellulare. IP e PI sono distribuiti in più compartimenti subcellulari, come il nucleo2,3,14,15, reticolo endolasmico16,17, plasma membrana1 e citosol18, associati alle proteine3,19 o con RNA20.

La scissione del PI(4,5)P2 associato alla membrana dalla fosforaC determina il rilascio di Ins(1,4,5)P3, che può essere fosforilata o dephophorylated da kinasi IP e fosfoforasi, rispettivamente. Gli IP sono molecole solubili che possono legarsi alle proteine ed esercitare funzioni regolatorie. Ad esempio, Ins(1,4,5)P3 in metazoo può agire come un secondo messaggero legandosi ai recettori IP3, che induce i cambiamenti conformazionali del recettore e quindi il rilascio di Ca2, dai negozi intracellulari11. Ins(1,3,4,5)P4 si lega al complesso della deacetylase istone e regola l’assemblaggio e l’attività complesse di proteine13. Altri esempi di funzione regolatrice degli IP includono il controllo dell’organizzazione della cromatina21, il trasporto dell’RNA22,23, l’editing RNA24e la trascrizione1,2,3 . Al contrario, i PI sono spesso associati al reclutamento di proteine nella membrana plasmatica o nelle membrane dell’orgelli25. Tuttavia, una proprietà emergente delle PI è la capacità di associarsi alle proteine in un ambiente non-membranoso3,15,19,26. Questo è il caso del recettore nucleare fattore steroidogenico, che la funzione di controllo trascrizionale è regolata da PI(3,4,5)P319, e poli-A polimerasi che l’attività ezimatica è regolata da NUCLEAR PI(4,5)P226. Un ruolo normativo per IP e PI è stato dimostrato in molti organismi tra cui lievito22,27, cellule di mammiferi19,23, Drosophila10 e vermi28. Di significato è il ruolo di questi metaboliti nei trypanosomi, che si sono differenziati presto dal lignaggio eucarotico. Questi metaboliti svolgono un ruolo essenziale nel trypanosoma brucei controllo trascrizionale1,3, sviluppo8, biogenesi organelle e traffico proteico29,30 , 31 Milia , 32, e sono anche coinvolti nel controllo dello sviluppo e infezione nei patogeni T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 e Plasmodium 5 Del numero 3( , 37. Quindi, comprendere il ruolo degli IP e dei PI nei trypanosomi può aiutare a chiarire la nuova funzione biologica di queste molecole e a identificare nuovi bersagli farmacologici.

La specificità del legame di proteine e IP o PI dipende dalle proteine che interagiscono tra i domini e lo stato di fosforilazione dell’inositolo13,38, anche se le interazioni con la parte lipidica delle PI avvengono anche19. La varietà di IP e PI e la loro modifica di chinasi e fosfolenosi fornisce un meccanismo cellulare flessibile per controllare la funzione proteica che è influenzato dalla disponibilità e dall’abbondanza di metaboliti, dallo stato di fosforolalazione dell’inositolo e dalle proteine affinità di interazione1,3,13,38. Anche se alcuni domini proteici sono ben caratterizzati39,40,41, ad esempio, pleckstrin homology dominio42 e SPX (SYG1 /Pho81 /XPR1) domini43 ,44,45, alcune proteine interagiscono con IP o PI con meccanismi che rimangono sconosciuti. Ad esempio, la proteina repressore-attivatore 1 (RAP1) di T. brucei manca di domini di legame PI canonici, ma interagisce con PI(3,4,5)P3 e la trascrizione di controllo dei geni coinvolti nella variazione antigenica3. La cromatografia di affinità e l’analisi della spettrometria di massa delle proteine interagenti IP o PI da cellule tripitosomi, lievito o mammiferi hanno identificato diverse proteine senza domini di legame IP o PI noti8,46, 47. I dati suggeriscono ulteriori domini proteici non caratterizzati che si legano a questi metaboliti. Quindi, l’identificazione delle proteine che interagiscono con IP o PI può rivelare nuovi meccanismi di interazione proteina-metabolita e nuove funzioni regolatorie cellulari per queste piccole molecole.

Il metodo qui descritto utilizza la cromatografia di affinità accoppiata alla blotrotazione occidentale o alla spettrometria di massa per identificare le proteine che si legano a IP o PI. Esso utilizza IP biotinylati o PI che sono o cross-linked a streptavidin a perline di agarose o in alternativa, catturato tramite perline magnetiche coniugate streptavidin (Figura 1). Il metodo fornisce un flusso di lavoro semplice, sensibile, non radioattivo, privo di liposomi ed è adatto per rilevare il legame delle proteine da lismi cellulari o proteine purificate3 (Figura 2). Il metodo può essere utilizzato in una spettrometria di massa quantitativada 8,46 o accoppiato a una spettrometria di massa quantitativa con etichetta di aminoacidi47 per identificare proteine IP o PI-leganti da campioni biologici complessi. Quindi, questo metodo è un’alternativa ai pochi metodi disponibili per studiare l’interazione di IP o PI con proteine cellulari e aiuterà a comprendere la funzione regolatoria di questi metaboliti nei trypanosomi e forse in altri eucarioti.

Protocol

1. Analisi delle proteine che legano IP o PI mediante cromatografia di affinità e gonfiore occidentale Crescita cellulare, lisi e cromatografia di affinità Coltivano le cellule T. brucei fino alla fase intermedia del log e monitorano la vitalità e la densità delle cellule. Un totale di 5,0 x 107 celle è sufficiente per un saggio vincolante. Per le forme del flusso sanguigno, far crescere le cellule nei media HMI-9 integrati con 10% siero bovino fetale (…

Representative Results

Analisi dell’interazione RAP1 e PI(3,4,5)P3 mediante cromatografia di affinità e gonfiore occidentaleIn questo esempio viene illustrata l’applicazione di questo metodo per analizzare l’associazione di PI da RAP1 da T. brucei lysate o dalla proteina ricombinante T. brucei RAP1. Lysates di T. brucei forme di flusso sanguigno che esprimono emagglutinina (HA) taggato RAP1 sono stati utilizzati nei saggi vincolanti. RAP1 è una proteina coinvolta nel controllo trascrizionale de…

Discussion

L’identificazione di proteine che si legano a IP o PI è fondamentale per comprendere la funzione cellulare di questi metaboliti. La cromatografia di affinità abbinata alla spettrometria di massa o macchia occidentale offre l’opportunità di identificare le proteine interagenti IP o PI e quindi di ottenere informazioni sulla loro funzione regolatoria. IP o PI etichettati chimicamente [ad esempio, Ins(1,4,5)P3 chimicamente collegati alla biotina] e incrociati alle perline di agarose tramite streptavidina o catturati da p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch Supplemento per i ricercatori all’inizio della carriera (DGECR-2019-00081) e dalla McGill University.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
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References

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Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay
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Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
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